Una en - Almacenamiento criogénico Co., Ltd de Chengdu

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1545 (2023) Citar este artículo

1750 Accesos

21 Altmetric

Detalles de métricas

La proteasa principal del SARS-CoV-2 (Mpro) es responsable de la escisión de la poliproteína viral. El autoprocesamiento de Mpro se denomina maduración y es crucial para la dimerización y la actividad de las enzimas. Aquí usamos C145S Mpro para estudiar la estructura y la dinámica de la escisión N-terminal en solución. El análisis de espectroscopia de masas nativo muestra que los estados oligoméricos mixtos están compuestos de partículas escindidas y no escindidas, lo que indica que el procesamiento N-terminal no es crítico para la dimerización. Una estructura crio-EM de 3,5 Å proporciona detalles de la escisión del terminal N de Mpro fuera de las restricciones del entorno cristalino. Mostramos que las diferentes clases de inhibidores cambian el equilibrio entre los estados oligoméricos. Mientras que el inhibidor no covalente MAT-POS-e194df51-1 previene la dimerización, el inhibidor covalente nirmatrelvir induce la conversión de monómeros en dímeros, incluso con extremos N intactos. Nuestros datos indican que la dimerización de Mpro se desencadena por el ajuste inducido debido al enlace covalente durante el procesamiento del sustrato en lugar del procesamiento N-terminal.

El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) es el agente causal de COVID-191. Al igual que el SARS-CoV y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV), el SARS-CoV-2 es un virus de ARN monocatenario (ssRNA) que pertenece al género de los beta-coronavirus1,2. El genoma del SARS-CoV-2 está compuesto por casi 30 000 nucleótidos que contienen el gen ORF1ab, un gran marco de lectura abierto (ORF) responsable de codificar 16 proteínas no estructurales (nsp) como dos poliproteínas después del cambio de marco ribosómico, denominadas 1a y 1b1,2,3. El procesamiento proteolítico de las poliproteínas virales es esencial para el ciclo de vida viral y lo realizan dos cisteína proteasas codificadas por el SARS-CoV-2: la proteasa similar a la papaína (PLpro), que es uno de los dominios de nsp3, y la proteasa viral principal (Mpro o 3CLpro), codificado por el nsp54,5. PLpro escinde la poliproteína viral en tres sitios, mientras que Mpro es responsable de escindir la poliproteína en once sitios distintos4,5, incluidos sus propios extremos N y C6. Mpro es uno de los objetivos más prometedores para el desarrollo de fármacos contra el SARS-CoV-25,7. Toda la información estructural y bioquímica recopilada sobre este objetivo ha sido crucial para el rápido desarrollo de nuevos antivirales8,9,10,11, incluido el reciente fármaco Paxlovid/nirmatrelvir10, aprobado para uso de emergencia en EE. UU., Europa y China.

Para obtener Mpro madura heteróloga expresada, los investigadores adoptaron la estrategia general de agregar la porción C-terminal de nsp4 a la porción N-terminal de las construcciones de nsp5, lo que permite la autoescisión y la dimerización de Mpro in vitro6. Anteriormente, describimos la actividad y el perfil bioquímico del mutante SARS-CoV-2 Mpro C145S que contiene la porción C-terminal de nsp4 en su N-terminal6. Esta mutación de serina generó una versión activa pero mucho más lenta de Mpro, una valiosa herramienta para estudiar los aspectos bioquímicos de esta enzima. A diferencia del dimérico Mpro, esta muestra se comportó como una mezcla dinámica de monómeros, dímeros, trímeros y tetrámeros en solución6. La actividad residual de este mutante de serina permitió la escisión lenta del péptido N-terminal nsp4-nsp5, lo que nos permitió monitorear los estados oligoméricos de Mpro en solución durante el proceso de maduración6. Observamos que la forma tetramérica de Mpro C145S alcanza el equilibrio como dímeros en el transcurso de dos días, en un fenómeno que es directamente proporcional a la escisión N-terminal, por lo que se infiere que el procesamiento N-terminal fue crítico para la dimerización6. Además, revelamos previamente la estructura cristalina de Mpro C145S en complejo con el péptido C-terminal nsp5-nsp6, obtenido de la muestra tetramérica de Mpro, que presenta una descripción detallada de este evento de maduración de escisión clave. En resumen, dos dímeros Mpro maduros se ensamblan en un complejo transitorio dímero-dímero, posicionando el C-terminal de una molécula Mpro hacia el sitio activo de otra, y seguido por el procesamiento C-terminal en un evento de escisión trans6.

Aquí informamos la estructura de microscopía crioelectrónica (crio-EM) del mutante SARS-CoV-2 Mpro C145S que contiene la porción de escisión nsp4-nsp5, con una resolución de 3,5 Å. En esta estructura, vislumbramos el estado en solución de Mpro, unido a dos protómeros nsp5 desplegados durante el procesamiento N-terminal. Demostramos que la dimerización no depende del procesamiento N-terminal, como se suponía anteriormente, sino que probablemente sea una consecuencia del ajuste inducido requerido para el enlace covalente durante el procesamiento del sustrato.

El análisis de espectroscopía de masas nativa de picos que contienen multímeros de SARS-CoV-2 Mpro C145S reveló que la muestra está compuesta por una mezcla de monómeros, dímeros, trímeros y tetrámeros (Fig. 1), como lo indicó previamente el análisis SEC-MALS6. Además, observamos partículas de monómero que contienen secuencias de péptido nsp4-nsp5 no plegado y desplegado. De acuerdo con nuestro modelo anterior de maduración, en el que la escisión del péptido N-terminal sirve como desencadenante de la dimerización.

De izquierda a derecha, los picos muestran monómeros escindidos (semicírculo azul) y no escindidos (semicírculo rojo), dímeros formados por partículas escindidas (círculos azules) o semiescindidas (círculo azul-rojo), trímeros formados por dos partículas escindidas y una no escindida ( dos tercios azules, un tercio círculos rojos) y tetrámeros formados por dos partículas escindidas y dos no escindidas (dos cuartos azules, dos cuartos rojas). Los picos menores de otras formas se describen en materiales complementarios. Los gráficos se trazaron a partir de experimentos de espectrometría de masas nativos individuales.

Sin embargo, la espectroscopia de masas nativa también reveló que los picos que contienen estados oligoméricos podrían formarse mediante la combinación de partículas nsp4-nsp5 no escindidas (masa teórica de 34 554,54 Da) y escindidas (masa teórica de 33 780,58 Da). Lo mismo ocurre con los picos de trímeros o tetrámeros, que sorprendentemente podrían estar compuestos por todas las posibilidades combinatorias de péptidos escindidos y no escindidos (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria). Esto contradice los modelos preliminares de maduración de Mpro, en los que el procesamiento N-terminal dicta la dimerización6,12,13. También queda claro por las cantidades relativas de masa que los equilibrios de los estados oligoméricos favorecen los estados donde están presentes más elementos escindidos (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria), aún acorde con ese modelo donde la escisión N-terminal está directamente involucrada en la dimerización .

Para confirmar estos resultados, realizamos un análisis secundario de espectroscopia de masa nativa de la muestra 2 utilizando una configuración diferente. Usando un UHMR Q-Exactive de Orbitrap, se observaron siete distribuciones de estado de carga. Comparamos los datos con la ejecución anterior del instrumento Agilent en la Fig. 6 complementaria. Una distribución de estado de carga abundante cerca de m/z ~ 2500 y centrada en el ion 11+ corresponde a Mpro con una masa molecular de 34 556 ± 24 Da (m1 en la Fig. complementaria 6). También se observa una distribución de estado de carga de baja abundancia con una magnitud similar de la carga, que corresponde a una especie con masa 33,865 ± 44 Da (m2 en la Fig. 6 complementaria). Estas dos distribuciones de estado de carga se pueden asignar a los diferentes monómeros Mpro. Se pueden encontrar múltiples series de picos entre m/z 4000–5000 (todos ellos centrados en el estado de carga 16 + ), que corresponden a iones con pesos moleculares consistentes con homodímeros m1m1 y heterodímeros m1m2, es decir, 67 687 ± 44 Da para homodímeros y 68.466 ± 9 Da para heterodímeros. Curiosamente, los picos adicionales en el espectro corresponden al estado de carga que se desconvolucionan a pesos moleculares que son consistentes con estados oligoméricos de orden superior, con diferentes cantidades de m1 y m2. Aún así, los datos muestran que la muestra 2 está compuesta de partículas nativas que combinan protómeros escindidos y no escindidos, lo que confirma nuestra observación anterior.

Aquí describimos la estructura crio-Em de SARS-CoV-2 Mpro C145S a 3,5 Å (Fig. 2). El modelo final mostró los 306 residuos de C145S Mpro visibles para ambas cadenas, además de una clara evidencia de un péptido de al menos 11 residuos de largo que ocupa ambos sitios activos (Fig. 3a). El modelo final no mostró rotámeros, Cβ o valores atípicos de Ramachandran, y un coeficiente de correlación (CC) del modelo de mapa de 0.80 (Fig. 3b, c). El modelo y/o mapa fueron depositados bajo los códigos 8EY2 (para PDB) y EMD-28666 (para EMDB). El modelo crio-EM final es muy similar a las estructuras conocidas de rayos X (Fig. 3d), con un RMSD de 0,7 Å (para 3909 átomos) en comparación con la forma dimérica madura de Mpro (PDB 7KPH), o 1,2 Å (para 3.822 átomos) en comparación con la estructura de rayos X del mutante C145S (PDB 7N5Z) (Fig. 3d y e). Las estadísticas y los parámetros de la recopilación y el procesamiento de datos están disponibles en la Tabla 1.

a Micrografías alineadas, con barra de escala en la parte inferior. b Función CTF calculada a partir de micrografías obtenidas. c Ejemplos de partículas extraídas. d Esquema detallado de los pasos tomados para la reconstrucción final, destacando las clases 2D y 3D obtenidas, y la primera reconstrucción de alta resolución. e Correlación de capa de Fourier (FSC) entre medios mapas de las reconstrucciones finales. En la parte superior, el gráfico muestra los FSC frente a la frecuencia espacial calculada en las direcciones x (azul), y (verde) y z (rojo). La fase de coseno promedio está en negro y el FSC global se representa en amarillo. En la parte inferior, porcentaje de FSC por ángulo (azul) superpuesto con gráfico FSC estándar de oro (rojo). f Resolución local proyectada sobre el mapa final desde dos orientaciones.

una vista de rotación de cuatro lados del mapa final que se muestra como superficie, con las cadenas A y B coloreadas en blanco y gris, respectivamente, y el mapa de péptidos del sitio activo coloreado en cian. b Modelo de dominio III de cadena A (azul) ajustado en el mapa final (gris). c Región de interfaz de la cadena A (azul) y B (salmón) ajustada en el mapa crio-EM final (gris). d Superposición del modelo X-ray Mpro (amarillo, PDB 7KPH), X-ray SARS-CoV-2 C145S Mpro (rosa, PDB 7N5Z) y modelo SARS-CoV-2 C145S Mpro cryo-EM (azul oscuro). e SARS-CoV-2 C145S Mpro crio-EM modelo cadena A (izquierda) y (derecha) coloreados según su RMSD versus modelo de rayos X de Mpro (PDB 7KPH).

Previamente se asumió que la muestra tetramérica de Mpro C145S observada en la solución tenía la misma organización que la obtenida con estructura cristalina de asociación dímero-dímero6. Sin embargo, la estructura crio-EM de Mpro C145S reveló una partícula dimérica de Mpro anclada a la región nsp4-nsp5 en el momento que precede a la escisión, con una densidad detallada de residuos clave P y P' (Fig. 3a). La estructura de resolución de 3,5 Å proporciona información estructural sobre un paso importante de la maduración de Mpro, la escisión N-terminal, que muestra una clara densidad electrónica del péptido en ambas cadenas A y B del dímero (Fig. 3a). El mapa de potencial eléctrico alrededor del sitio activo Ser145* indica una interacción no covalente del péptido nsp4/nps5 (residuos SAVLQ de nsp4 y residuos 1-6 de nsp5 Mpro, SGFRKM), formando una hoja β extendida mantenida principalmente por enlaces de hidrógeno en Thr24, Gly143, Ser145*, His163, Glu166 y Gln189 (Fig. 4a). Las posiciones de sustrato exhibieron una posición de unión muy parecida a las estructuras cristalográficas de Mpro en complejo con el sustrato peptídico fisiológico (PDBid 7N6N y 7DVP) con valores RMSD de 0,57 y 0,9 respectivamente calculados entre 30 y 54 átomos.

una vista del sitio activo de la superficie de la cadena A de Mpro C145S (en gris) unida al péptido nsp4-nsp5 (barras amarillas). Los subsitios se indican de S4 a S5'. b Vista detallada de los residuos del sitio activo de la cadena A de Mpro C145S (en gris) unidos al péptido nsp4-nsp5 (barras amarillas), con el mapa crio-EM mostrado como superficie (nivel de contorno de 4,55). c Esquema de interacción entre el péptido nsp4-nsp5 y la cadena A de Mpro C145S. d Partículas filtradas de paso bajo seleccionadas, destacando las partículas dímeras (marcadas con una línea azul) unidas a partículas monoméricas no escindidas (marcadas con una línea roja). La barra de escala se muestra en la parte inferior izquierda. e Representación esquemática del dímero Mpro C145S (azul) unido a partículas no escindidas (rojo).

En el modelo crio-EM, podemos ver a Gln0 ocupando el subsitio S1, con su resto de cadena lateral NE2 interactuando con el átomo OE1 del residuo Glu166 a través de un enlace de hidrógeno (2,7 Å y 2,5 Å para las cadenas A y B, respectivamente). Además, el átomo OG de Ser145* forma un enlace de hidrógeno con el grupo hidroxilo de la cadena principal de Gln0. La amida de la cadena principal Gly143 dona un enlace de hidrógeno al oxígeno del carbonilo P1', estabilizando el agujero de oxianión durante la catálisis. Leu-1 en el subsitio S2 interactúa con Gln189 a través de un enlace de hidrógeno formado entre la amida de la cadena principal de Leu-1 y la cadena lateral OE1 de Gln189 (Fig. 4a, b). Met49, Met149 y Gln189 del subsitio S2 asumen una conformación más abierta en comparación con las formas no unidas capturadas de la enzima. En el subsitio S3, hay una interacción entre los átomos polares de la cadena principal Val-2 y la cadena lateral Glu166 (Fig. 4c). El grupo hidroxilo de la cadena principal Ala-3 en P4 dona un enlace de hidrógeno a NE2 de Gln189. La falta de interacciones polares entre los sitios de proteína S2-S4 con residuos de proteína ayudaría a explicar la variedad de distintos aminoácidos que estas posiciones están dispuestas a acomodar. El mapa de densidad de la partícula Mpro anclada al sitio activo solo se extiende hacia los residuos Met6 de Mpro, lo que sugiere que el resto de la partícula es demasiado móvil para la reconstrucción del modelo.

Al inspeccionar cuidadosamente las partículas filtradas de paso bajo utilizadas para la reconstrucción final, notamos una partícula satélite alargada anclada alrededor de cada una de las regiones de sitios activos de dímero, con tamaño y forma consistentes con un monómero parcialmente plegado de Mpro (Fig. 4d). En contraste con el complejo dímero-dímero formado durante la división C-terminal, estos protómeros alargados se distribuyen aleatoriamente alrededor del sitio activo, lo que indica que las partículas están mal plegadas (Fig. 4d, e). Además, las partículas alargadas en forma de monómeros nsp5 no parecen formar dímeros (Fig. 4e). Estas observaciones están en línea con nuestro modelo anterior de Mpro inmadura, en el que demostramos que la adición de tres aminoácidos no escindibles a su extremo N interrumpe el plegamiento de Mpro y evita la dimerización6. Sin embargo, nuestra estructura revela una vista única de la forma dimérica de Mpro atrapada durante la escisión de los N-terminales en solución. No pudimos generar clases 2D o 3D resaltando las partículas del satélite, lo que concuerda con la hipótesis parcialmente plegada.

Muchas simulaciones moleculares in-silico y estudios de acoplamiento han tratado de describir Mpro en el movimiento de la solución y el reconocimiento del sustrato14,15, no hay ningún modelo determinado experimentalmente disponible para validarlos libres del recinto de restricciones de cristal. Aquí, usamos el modelo crio-EM para estudiar la dinámica de Mpro durante la escisión N-terminal. Para eso, las partículas utilizadas para la reconstrucción del modelo se analizaron utilizando la herramienta cryoSPARC 3DVA para clasificar la variabilidad de la solución de Mpro. El primero de los cuatro componentes del vector propio explorados generó volúmenes de baja calidad que no eran interpretables. Los otros tres (componentes 2, 3 y 4) produjeron marcos de volumen que se utilizaron para el análisis de la variabilidad de partículas. En los tres, se puede ver un volumen con forma de Mpro unido al péptido nsp4 en ambos sitios activos, lo que sugiere que las partículas de otros estados oligoméricos se filtraron durante el procesamiento de datos. Como era de esperar, el análisis indica que la plasticidad conformacional más alta se concentra en la región del sitio activo de Mpro, con el RMSD más alto concentrado en las regiones de hélice 43-53, y en las horquillas β 19-27, 62-65 y 166 -171. Helix 43-53 contiene residuos clave que están involucrados en la formación del subsitio hidrofóbico S2, incluido Met49. Junto con Met165, Met49 forma una cavidad de reconocimiento de sustrato, con preferencia por las cadenas laterales hidrofóbicas como la leucina y la valina6. La horquilla β 19-27, responsable de la formación del subsitio S1', también parece ser notablemente móvil en comparación con el resto de la proteína.

El análisis indica que ambos sitios activos se están expandiendo y contrayendo gradualmente sobre los marcos (Fig. 2 complementaria). La expansión del sitio activo de Mpro ya se correlacionó con el sustrato y la unión del ligando6,16, por lo que es probable que esta variabilidad se correlacione con distintos momentos de anclaje del sustrato. La flexibilidad conformacional del sitio activo de Mpro durante la unión del sustrato y el ligando se ha observado previamente mediante cristalografía de rayos X criogénica y a temperatura ambiente6,17. Kneller et al. demostraron que durante la unión del ligando, los elementos estructurales secundarios que forman los subsitios P2-P5 se desplazan desde la posición original para acomodar el ligando/sustrato hasta 2,4 Å, cambiando la forma y el potencial electrostático del sitio17. Los movimientos de expansión-contracción del sitio activo parecen ser simétricos para ambos protómeros Mpro (Fig. 2 complementaria). Esto difiere significativamente de múltiples estudios in-silico que han demostrado que los protómeros Mpro son activos de forma independiente18,19,20, pero ayudaría a explicar por qué la dimerización es fundamental para la eficiencia enzimática total. La plasticidad del sitio activo de los coronavirus en solución Mpro es fundamental para comprender la dinámica enzimática y debería ayudar a las campañas de descubrimiento de fármacos, especialmente para aquellas plataformas que dependen del análisis in-silico de la interacción proteína-ligando, que a menudo no se correlacionan con los datos experimentales21.

La muestra C145S Mpro demostró ser una herramienta valiosa para investigar el comportamiento in vitro de Mpro 6. Aquí exploramos la capacidad de nuestro método para explorar el estudio del efecto de inhibidores potentes en la maduración de la enzima. Nuestro primer objeto fue el inhibidor competitivo no covalente MAT-POS-e194df51-1, desarrollado por la iniciativa COVID Moonshot, con un pIC50 de 7,5. Las muestras que contenían C145S Mpro monomérico (muestra 1) o C145S Mpro tetramérico (muestra 2) se incubaron con dos concentraciones de MAT-POS-e194df51-1, y su estado oligomérico se controló durante 48 h mediante SEC-MALS y se comparó con control. Para simplificar, se consideró que los trímeros formaban parte del grupo de tetrámeros.

A las 0 h, el control de la muestra 1 presentó una relación 1,0/0,0 (monómero/dímero), progresando a 0,88/0,12 a las 24 h y 0,39/0,61 a las 48 h (Fig. 5a). Con respecto a la muestra 1 que contenía 4:1 MAT-POS-e194df51-1/proteína, se mantuvo en una proporción de 1,0/0,0 monómero/dímero entre las 0 h y las 24 h, y solo progresó a 0,004/0,996 a las 48 h (Fig. 5b). La reducción de la relación molar MAT-POS-e194df51-1/proteína de 4:1 a 0,4:1 devolvió el comportamiento más cercano al del control, alcanzando una relación monómero/dímero de 0,89/0,11 a las 24 h y 0,74/0,25 a las 24 h. 48 horas La muestra 1 mostró que los monómeros desplegados básicamente forman dímeros completamente maduros con el tiempo. MAT-POS-e194df51-1 a la muestra 1, ambas concentraciones parecen inhibir la maduración del dímero y provocar la acumulación de partículas de monómeros desplegados. Con este experimento pudimos demostrar un efecto único de MAT-POS-e194df51-1 en el ciclo de la enzima que nunca se había visto, mostrando no solo su capacidad de competir con el sustrato sino también de bloquear el ciclo de maduración de la enzima y acumular poliproteína no escindida. En 2018, Constant et al demostraron para la proteasa NS3 del dengue que los inhibidores más efectivos deberían dirigirse específicamente a los sitios de escisión que acumularían precursores de proteínas virales no escindidas22. En este caso, este fenotipo inhibido podría inhibir de manera transdominante otros fenotipos virales en la célula, posiblemente suprimiendo la generación de variantes resistentes a los medicamentos. Serán necesarios más estudios para comprender el efecto de los elementos no escindidos en el metabolismo del SARS-CoV-2.

a Reacción de control que contiene monómeros a las 0 h (arriba), después de 24 h de incubación (medio) y después de 48 h (abajo). b Reacción de conversión de monómeros en presencia del inhibidor no covalente MAT-POS-e194df51-1 a las 0 h (arriba), después de 24 h de incubación (medio) y después de 48 h (abajo). c Reacción de conversión de monómeros en presencia del inhibidor covalente Nirmatrelvir a las 0 h (arriba), después de 24 h de incubación (medio) y después de 48 h (abajo).

Para el control de la muestra 2, vimos la relación de 0,43/0,34/0,23 masa de proteína de monómero/dímero/tetrámero detectada a las 0 h, cambiando a 0,09/0,89/0,02 a las 24 h y 0,0/0,98/0,02 a las 48 h (Fig. 6a). Para la muestra 2 que contenía 4:1 MAT-POS-e194df51-1/proteína, vimos la proporción de 0,49/0,45/0,05 masa de proteína de monómero/dímero/tetrámero detectada a las 0 h, cambiando a 0,49/0,51/0,0 a las 24 h y 0,45/0,55/0,02 a las 48 h (fig. 6b). Para la muestra 2 que contenía 0,4:1 MAT-POS-e194df51-1/proteína, vimos la proporción de 0,46/0,47/0,06 masa de proteína de monómero/dímero/tetrámero detectada a las 0 h, cambiando a 0,26/0,73/0,0 a las 24 h y 0,02/0,96/0,02 a las 48h.

a Reacción de control que contiene tetrámeros a las 0 h (arriba), después de 24 h de incubación (medio) y después de 48 h (abajo). b Reacción de conversión de tetrámeros en presencia del inhibidor no covalente MAT-POS-e194df51-1 a las 0 h (arriba), después de 24 h de incubación (medio) y después de 48 h (abajo). c Reacción de conversión de tetrámeros en presencia del inhibidor covalente Nirmatrelvir a las 0 h (arriba), después de 24 h de incubación (centro) y después de 48 h (abajo).

En el control de este experimento, vimos que la muestra se inicia como una mezcla de tetrámeros, dímeros y monómeros. En el transcurso de 48 h, tanto los monómeros como los tetrámeros se extinguen y se observa que los dímeros se vuelven predominantes. La presencia de MAT-POS-e194df51-1 en la muestra 2 parece causar el mismo efecto que en la muestra 1 de bloquear el consumo de monómeros, pero también parece acelerar el consumo de tetrámeros. Si pensamos en las muestras de tetrámeros como el complejo enzima-sustrato, es lógico que un inhibidor competitivo tenga este efecto en la muestra, ya que provoca la dislocación del sustrato desplegado que está unido al sitio activo de Mpro. En paralelo con la muestra 1, la conversión de monómeros a dímeros de la muestra 2 también fue bloqueada por la presencia de MAT-POS-e194df51-1, lo que revela que el inhibidor no solo bloquea la actividad, sino que también podría prevenir el proceso de maduración, lo que posiblemente mejore el efecto antiviral más allá de su potencia al objetivo.

El efecto del inhibidor covalente de Mpro Nirmatrelvir/PF-07321332 con un pIC50 de 7.710 también se probó contra muestras C145S. El efecto de esta molécula fue notablemente diferente al de MAT-POS-e194df51-1 (Fig. 5c). Para la muestra 1 que contenía 4:1 de nirmatrelvir/proteína, vimos la proporción de 0,65/0,35 entre la masa de proteína de monómeros/dímeros detectada a las 0 h, cambiando a 0,06/0,94 a las 24 h y 0,02/0,98 a las 48 h (Fig. 5c) . Para la muestra 2 que contenía 4:1 de nirmatrelvir/proteína, vimos la proporción de 0,31/0,56/0,12 entre la masa de proteína de monómeros/dímeros/tetrámeros detectada a las 0 h, cambiando a 0,0/0,88/0,12 a las 24 h y 0,0/0,98/0,02 a las 48 h (fig. 6c).

En la muestra 1, se observó que la presencia de nirmatrelvir induce fuertemente la formación de dímeros a partir de monómeros incluso a las cero horas y mejora significativamente la proporción de formación de dímeros a lo largo del tiempo, con una conversión casi total después de 24 h (Fig. 5c). En la muestra 2, el equilibrio de monómeros y tetrámeros también parece estar dislocado para favorecer la formación de dímeros (Fig. 6c). Mientras que para el tetrámero, el aumento del consumo podría explicarse simplemente por la competencia entre el nirmatrelvir y el complejo sustrato-enzima, la tasa acelerada de conversión de monómeros en dímeros fue completamente inesperada. Sin embargo, estos resultados únicos podrían arrojar luz sobre los detalles del primer paso de la maduración de proteínas, el procesamiento N-terminal.

Nuestro modelo inicial para este paso fue que la escisión N-terminal es una mezcla de eventos cis y trans, y su escisión adecuada eliminaría el obstáculo estérico que estaría impidiendo la dimerización6, lo cual estaba en línea con los modelos en prosa anteriores para el SARS-CoV Mpro 12,13. Sin embargo, el hecho de que el inhibidor covalente (pero no un no covalente) pueda inducir la dimerización en una muestra no escindida sugiere que el desencadenante de la dimerización no es el procesamiento N-terminal, sino el ajuste inducido causado por el propio enlace covalente. . Este modelo también explicaría por qué los oligómeros pueden formarse mediante la combinación de partículas no escindidas y escindidas en lugar de solo partículas escindidas (Fig. 1 complementaria).

Para confirmar esta hipótesis, cristalizamos los monómeros Mpro C145S en presencia de Nirmatrelvir. La estructura cristalina reveló que, a pesar de la mutación C145S, el nirmatrelvir está unido covalentemente a la proteína. No obstante, también observamos el desplazamiento de las hélices Mpro αF, αH y αI del Dominio III adyacente, que parece ser causado por el impedimento estérico de los aminoácidos N-terminales no escindidos (Fig. 7). Esto es como nuestra estructura anterior de Mpro inmadura, con la excepción de que no vemos el desplazamiento de los residuos del sitio activo Phe140, Glu166, Pro168 y Gln1896. Esto sugirió que el enlace covalente permite la remodelación adecuada del sitio activo, lo que permite el evento de dimerización incluso en ausencia de una escisión N-terminal adecuada. Se podría inferir que para evitar la dimerización, un inhibidor debe ser no covalente e inhibir con éxito la unión de la forma monomérica de Mpro a los once sitios de escisión distintos en la poliproteína viral.

Los carbonos alfa Ser1 y Gln-1 se destacan como esferas rojas. Native Mpro se muestra como una caricatura gris transparente, con el carbono alfa Ser1 resaltado como una esfera verde.

Si uno combina la estructura crio-EM del mutante C145S unido a un péptido no escindido con nuestra estructura de rayos X anterior de C145S (PDB 7N6N) cadenas A (péptido escindido unido covalentemente a Ser145) y cadena B (péptido post-escindido), puede vislumbrar las modificaciones estructurales de Mpro durante todos los pasos del procesamiento enzimático (Fig. 8). Estas estructuras revelan que el proceso enzimático comienza con aminoácidos clave posicionados de manera similar a la estructura apo (Fig. 8a), pero el bucle β166-171 debe empujarse hacia el núcleo de la enzima para acomodar los péptidos sustrato P3-P5 (Fig. 8b). A continuación, durante el intermediario enzima-sustrato covalente, este bucle β166-171 debe empujarse aún más hacia el núcleo de la enzima para permitir una distancia covalente más corta entre C/S145 y el carbonilo C del enlace escindible y un anclaje adecuado al sitio activo, mientras que las hélices 43-53 y 62-65 muestran una conformación suelta (Fig. 8c). Después de la escisión, el péptido producto ya no se une a C/S145, lo que permite que el dominio del sitio activo vuelva a su conformación apo (Fig. 8d). Durante este proceso, la superficie del sitio activo de Mpro sufre importantes modificaciones estructurales y de potencial electrostático para acomodar todas las conformaciones intermedias enzima-sustrato, ahora detalladas en esta serie de estructuras (Fig. 8).

a Residuos clave del sitio activo (palos verdes) de Mpro en forma apo (arriba), vista de dibujos animados del sitio activo en estado apo en amarillo (centro) y potencial electrostático calculado proyectado en la superficie del sitio activo de Mpro (abajo). b Residuos clave del sitio activo (barras verdes) de Mpro C145S unido al péptido intacto (arriba), vista de dibujos animados del sitio activo desde la forma respectiva (medio) y potencial electrostático calculado proyectado de la forma respectiva (abajo). c Residuos clave del sitio activo (barras verdes) de Mpro C145S unidos covalentemente al péptido escindido que forma el complejo intermediario enzima-sustrato (arriba), vista de dibujos animados del sitio activo desde la forma respectiva (centro) y potencial electrostático calculado proyectado de la forma respectiva (abajo ). d Residuos clave del sitio activo (barras verdes) de Mpro C145S en complejo con péptido post-escindido (arriba), vista de dibujos animados del sitio activo desde la forma respectiva (medio) y potencial electrostático calculado proyectado de la forma respectiva (abajo). Los palos transparentes y los dibujos animados (grises) en las figuras superior e intermedia representan la posición estructural de los elementos relativos del paso anterior.

El SARS-CoV-2 Mpro es una proteína de 34 kDa de tres dominios que es esencialmente activa como un dímero5,6. Desde que se depositó la primera estructura de rayos X de SARS-CoV-2 Mpro en el Protein Data Bank (PDB) con el código 6LU7 en febrero de 202023, hay casi 450 estructuras actualizadas de Mpro disponibles en el PDB hasta 1,2 Å resolución (PDB 7K3T), lo que convierte al Mpro en uno de los SARS-CoV-2 nsp's33 estructuralmente mejor caracterizados. El Mpro se caracterizó por rayos X en complejo con múltiples nuevos fármacos candidatos5,24,25,26,27 y moléculas de reutilización24,28,29, fragmentos de grandes campañas de cribado de fragmentos30, así como péptidos endógenos6,16,31 y péptidos -candidatos a fármacos miméticos32. Además, las estructuras de rayos X a temperatura ambiente y criogénica y la cristalografía de neutrones se utilizaron con éxito para proporcionar información valiosa para detallar el mecanismo de acción de Mpro16,33, así como los cambios conformacionales durante el reconocimiento de sustrato y ligando6,17. Sin embargo, la estructura crio-EM de Mpro que se informa aquí revela características únicas del reconocimiento enzima-sustrato y la dinámica en solución.

También mostramos que la escisión N-terminal de Mpro es importante para el plegamiento adecuado de la proteína, pero no crítica para la dimerización. Nuestros datos sugieren que el evento de dimerización se rige por el ajuste inducido de la proteína durante la formación de un enlace covalente durante la escisión. Esto probablemente significa que la escisión de cualquiera de los once sitios objetivo de Mpro viral serviría como desencadenante de la dimerización, independientemente del estado del extremo N-terminal. Estas observaciones difieren de los modelos propuestos anteriormente, en los que la escisión en cis de N y C-terminal entre dos protómeros son necesariamente el paso inicial del proceso de maduración13,34. De hecho, estudios previos habían demostrado que la dimerización inducida por sustrato puede ocurrir en un modelo in vitro de la poliproteína viral, donde los terminales N y C se unen a otras proteínas35. Nuestro modelo también podría explicar por qué los estudios de Mpro que usaron otras estrategias para la producción de proteínas que generaron extremos N auténticos, como los casos de MERS-CoV Mpro donde los autores optaron por usar trombina en los extremos N (por lo tanto, no permitieron que la proteína realizar la escisión interna y la maduración completa) había generado una proteína que se comporta principalmente como monómeros 36. Curiosamente, los autores también informaron que la dimerización de MERS-CoV Mpro podría desencadenarse por el sustrato, lo que también está de acuerdo con nuestro modo propuesto36. Aún así, se requieren más datos para concluir que las Mpro nacientes se procesan y se convierten en maduras, y si este proceso depende del evento de procesamiento, la partícula procesada o una combinación de ambos. Estas observaciones afectan nuestra comprensión del proceso de maduración de los coronavirus Mpro, así como las diferencias farmacodinámicas entre los inhibidores covalentes y no covalentes.

Los detalles de la planificación de la construcción, la clonación y la expresión de proteínas se proporcionan en otro lugar6. Brevemente, la plantilla de cDNA viral (GenBank MT126808.1), proporcionada amablemente por el Dr. Edison Durigon (Universidad de São Paulo, São Paulo, Brasil), se usó para clonar la región codificante de la región codificante de Mpro (residuos 3264-3569) utilizando los cebadores: Fw 5' CAGGGCGCCATGAGTGGTTTTAGAAAAATGGCATTC 3' y Rv 5' GACCCGACGCGGTTATTGGAAAGTAACACCTGAGAC 3'. Esta secuencia se insertó en el vector pET_M11 utilizando el método LIC37. Luego, este plásmido se usó como molde para la inserción de residuos N-terminales nativos de Mpro (GAMSAVLQ ↓ SGFRK) mediante PCR inversa usando cebadores: Fw: 5' GCTGCAGAGTGGTTTTAGAAAAATGGCATTC 3' y Rv: 5' ACGGCTGACATGGCGCCCTGAAAATA 3'. Luego, la mutación C145S se insertó en este plásmido por PCR inversa usando los cebadores Fw 5' CCTTAATGGTTCATCTGGTAGTG 3' y Rv 5' AATGAACCCTTAATAGTGAAATTGG 3', dando como resultado el pET_M11-C145S-Mpro. Esta construcción contiene una etiqueta de histidina N-terminal 6x seguida de un sitio de escisión TEV, y la secuencia de reconocimiento de aminoácidos C-terminal nsp4 (Ser-4, Ala-3, Val-2, Leu-1, Gln-0 ↓) seguida por la secuencia Mpro que contiene la sustitución C145S6.

Para la producción de proteínas, se utilizó pET_M11-C145S-Mpro para transformar células de E. coli BL21 y se cultivaron en medio ZYM-505238 a 37 oC y 200 RPM a una OD600 de 0,8, seguido de expresión a 18 °C, 200 RPM durante 16 h . Las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 g durante 40 min a 4 °C, se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM, DTT 1 mM) y se rompieron mediante sonicación. El lisado que contenía proteína soluble se aclaró mediante centrifugación a 12,00x g durante 30 min a 4 °C.

C145S Mpro se purificó mediante cromatografía de metales inmovilizados (IMAC) utilizando una columna HisTrap FF de 5 ml (GE Healthcare). Después de lavar la columna con tampón A (Tris 20 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM, imidazol 25 mM), la proteína se eluyó con tampón A suplementado con imidazol 250 mM. La muestra se intercambió de tampón utilizando una columna de desalinización HiTrap de 5 ml (GE Healthcare) equilibrada con tampón A. Para eliminar la etiqueta 6xHis, se agregaron a la muestra 2 mg de proteasa TEV y DTT 4 mM y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, la proteína no escindida y el TEV se eliminaron mediante un segundo paso de IMAC en tampón A. Luego, la proteína se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) utilizando una columna HiLoad 16/60 Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrada con gel. tampón de filtración (Tris 20 mM pH 7,8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). El perfil SEC de esta muestra mostró múltiples picos superpuestos de estados oligoméricos mixtos de Mpro, como se describió anteriormente6. Los picos con mayor tiempo de retención están compuestos principalmente por tetrámeros (muestra 1), mientras que los picos con menor tiempo de retención están compuestos principalmente por tetrámeros (muestra 2). La pureza de la proteína se analizó mediante SDS-PAGE y se cuantificó utilizando el coeficiente de extinción teórico de 32 890 M−1.cm−1 39. Las fracciones recién purificadas de ambos picos se dividieron en alícuotas de 10 mg.mL−1 y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido.

Para la preparación de la rejilla, las muestras de C145S Mpro recién purificadas del pico tetrámero de SEC (muestra 2) se descongelaron en hielo, se centrifugaron y se diluyeron en tampón de filtración en gel. Luego, se aplicaron 3 µL de 0,25 mg.ml−1 de muestras en una rejilla Cu R2/2 de malla Quantifoil 300 de descarga luminiscente. La rejilla se secó utilizando Vitrobot (FEI) durante 2,5 s con fuerza de transferencia 1 a una humedad del 100 % y 4 °C antes de sumergir la congelación en etano líquido.

Los datos se recopilaron en Titan Krios operado a 300 kV utilizando un detector K3 en modo de superresolución contado con un ancho de rendija de 20 eV a un aumento nominal de 130k x correspondiente a un tamaño de píxel calibrado de 0,653 Å al nivel de la muestra. Las películas se grabaron durante 1 segundo a una tasa de dosis de 18,5 e-/px/s y se fraccionaron en 43 fotogramas. La adquisición de datos se realizó con ThermoFisher Scientific EPU 2.12 con un rango de desenfoque de −0,5 a −2,5 µm.

Para la determinación de la estructura de alta resolución, las 13 770 películas de superresolución recopiladas en Titán se ponderaron por dosis, se alinearon y se agruparon dos veces utilizando MotionCor240,41 implementado en RELION v3.141, lo que resultó en un píxel físico de 0,653 Å. La función de transferencia de contraste (CTF) de las micrografías resultantes se estimó utilizando CTFFIND-v4.142.

Se seleccionaron 1 956 496 partículas usando SPHIRE-crYOLO43 y se muestrearon en un factor de 3, extraídas con un tamaño de caja de 72 px. Las partículas se filtraron y clasificaron con 3 rondas de clasificación 2D. Se seleccionaron 569.725 partículas buenas para el modelo 3D De novo. Las partículas se volvieron a extraer con resolución completa. Las partículas se filtraron y clasificaron con clasificación 3D. Las partículas de la mejor clase 3D se seleccionaron para el refinamiento 3D y el pulido bayesiano en Relion v3.144.

El volumen de Refine3D y las 227 534 partículas brillantes se importaron luego a cryoSPARC v3.2.0 para su refinamiento45. Para la estructura depositada, el mapa se refinó inicialmente utilizando el algoritmo de refinamiento homogéneo con 1 paso final adicional, resolución de paso bajo inicial de 7 Å y simetría aplicada C2, lo que resultó en un mapa refinado con correlación de capa de Fourier estándar de oro (gsFSC) de 3,75 Å46. El mapa resultante se usó para el Refinamiento no uniforme47 con 1 paso final adicional, resolución de paso bajo inicial de 8 Å, simetría aplicada C2, optimización de desenfoque por partícula y optimización de CTF por grupo, lo que resultó en un mapa refinado con gsFSC de 3,6 Å. El mapa resultante se refinó utilizando el algoritmo de refinamiento local con simetría impuesta por C2, lo que resultó en un mapa con gsFSC de 3,5 Å. También se probó el mismo protocolo con simetría C1, lo que resultó en un mapa casi idéntico con gsFSC de 3,76 Å. Por lo tanto, el mapa C2 se utilizó para modelar y refinar más. La resolución del mapa se calculó utilizando la resolución local cryoSPARC y el servidor de procesamiento 3DFSC48. Las estadísticas de recopilación de datos, procesamiento y refinamiento del modelo para el C2 están disponibles en la Tabla 1. El esquema de los pasos de procesamiento de datos está disponible en la Fig. 2.

El acoplamiento inicial del modelo al mapa se realizó con PDB 7N6N y el mapa mejorado de cryoSPARC con UCSF ChimeraX v1.2.549. Para afinar y mejorar la visualización del mapa de alta resolución, utilizamos phenix auto-sharpen50. La construcción y el refinamiento del modelo se realizaron con Phenix Real Space Refinement51 y Coot52, y la validación se realizó con MolProbity53. Las figuras se prepararon utilizando PyMOL y ChimeraX v1.2.5. Las estadísticas del refinamiento del modelo están disponibles en la Tabla 1.

Para analizar la variabilidad de las partículas de SARS-CoV-2 Mpro C145S, utilizamos la herramienta de análisis de variabilidad 3D (3DVA) disponible en cryoSPARC v3.2.054. Para eso, las 569 725 partículas de tamaño completo utilizadas durante la clasificación 3D del procesamiento de datos crio-EM (en Relion) se importaron en cryoSPARC v3.2.0. Estas partículas y el volumen de Refine3D se incorporaron en un ciclo de refinamiento homogéneo sin simetría. Luego, las partículas y la máscara se usaron para calcular 4 vectores propios de la matriz de covarianza de la distribución de datos usando 3DVA54, con una resolución filtrada a 5 Å. Las series de modelos se generaron utilizando la herramienta de visualización 3DVA. Las imágenes se generaron con ChimeraX v1.2.5.

La cromatografía de fase inversa se realizó en línea antes de la espectrometría de masas utilizando un sistema HPLC Agilent 1100 (Agilent Technologies inc. – Palo Alto, CA, EE. UU.). Una muestra de C145S recién preparada que contenía picos tetraméricos (muestra 2) se diluyó a 20 µg/ml en ácido fórmico al 0,1 % y se inyectaron cincuenta µl en una precolumna Zorbax 300SB-C3 de 2,1 mm × 12,5 mm y 5 µm alojada en un horno de columna ajustado a 40 oC. El sistema de disolventes utilizado consistió en ácido fórmico al 0,1 % en agua de grado LC-MS (Millipore, disolvente A) y ácido fórmico al 0,1 % en metanol (grado LC-MS, Chromasolve, disolvente B). La cromatografía se realizó como sigue: las condiciones iniciales fueron 90 % A y 10 % B y un caudal de 1,0 ml/min. Después de 15 s al 10 % B, se aplicó un gradiente lineal de dos etapas de 10 % B a 80 % B durante 45 s y luego de 80 % B a 95 % B durante 3 s. A continuación, la elución procedió isocráticamente al 95 % de B durante 1 min 12 s seguido de equilibrio en las condiciones iniciales durante 45 s más. La masa intacta de proteína se determinó utilizando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo ortogonal de ionización por electropulverización MSD-ToF (Agilent Technologies Inc. - Palo Alto, CA, EE. UU.). El instrumento se configuró con la fuente ESI estándar y se operó en modo de iones positivos. La fuente de iones se hizo funcionar con el voltaje del capilar a 4000 V, la presión del nebulizador a 60 psig, el gas de secado a 350 °C y el caudal de gas de secado a 12 L/min. Los voltajes de la óptica iónica del instrumento fueron los siguientes: fragmentador 250 V, skimmer 60 V y octopolo RF 250 V.

Para la espectrometría de masas nativa, una muestra de la muestra 2 recién preparada se mantuvo en hielo y el tampón se intercambió en 75 µl de acetato de amonio 50 mM pH 7,5 mediante 3 rondas de filtración en gel utilizando columnas giratorias BioGel P6 (Biorad) según las instrucciones del fabricante. Los espectros de masas se adquirieron usando un Agilent 6530 QTOF que funciona en modo de iones positivos de 1 GHz usando una fuente ESI estándar. Las muestras se introdujeron mediante una bomba de jeringa a un caudal de 6 µl/min. La fuente de iones se hizo funcionar con el voltaje del capilar a 3500 V, la presión del nebulizador a 17 psig, el gas de secado a 325 oC y el caudal de gas de secado a 5 L/min. Los voltajes de la óptica iónica del instrumento fueron los siguientes: fragmentador 430 V, skimmer 65 V y octopolo RF 750 V. Esta misma configuración se utilizó para describir la forma nativa tetramérica de E. coli LacZ (masa teórica de 465 932 Da), con masa plegada observada de 466.092 Da para tetrámero55.

Los estados oligoméricos en solución de las muestras purificadas se evaluaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño acoplada con dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS). Todos los ensayos se realizaron en tampón de corrida compuesto por Tris-HCl 20 mM pH 7,8, NaCl 100 mM y DTT 1 mM, como se describió anteriormente6. Para eso, se inyectó una muestra de 50 µL de cada oligómero Mpro C145S a una concentración de 50 µM en un sistema Waters 600 HPLC (Waters) acoplado en línea con un detector UV, un aparato de dispersión de luz multiángulo miniDAWN TREOS (Wyatt Technology ), una columna Superdex 200 Increment 10/300 GL (GE Healthcare) con un caudal de 0,5 mL/min, y un detector de índice de refracción Optilab T-rEX (Wyatt Technology). Los detectores de dispersión de luz se normalizaron con albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich). Los datos fueron recolectados y analizados con el software integrado ASTRA 7, proporcionado por Wyatt.

Las muestras analizadas contenían 100 µg de monómeros o tetrámeros C145S Mpro que se incubaron con DMSO al 1 % (control) o ligando durante 0 h, 24 h o 48 h. El inhibidor no covalente MAT-POS-e194df51-1, obtenido de Moonshot COVID Consortium, se probó en una concentración de relación inhibidor:proteína de 4:1 y 0,4:1, y se incubó durante 0 h, 24 h o 48 h con cada muestra. El inhibidor covalente nirmatrelvir se probó en una concentración de relación inhibidor:proteína de 4:1 y se incubó durante 0 h, 24 h o 48 h. Dada la falta de resolución suficiente de los métodos, los picos de trímeros y tetrámeros se sumaron y trataron como tetrámeros. Todos los datos generados están disponibles en la Fig. 3 complementaria.

Las muestras de monómeros de C145S Mpro (muestra 1) a 5 mg/ml se incubaron con nirmatrelvir en una proporción de proteína:compuesto de 1:5 durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se colocaron placas de cristalización por goteo sentado usando MES 0,1 M pH 6,7 en condiciones, DMSO al 5 %, PEG 4000 al 8 % a 20 °C. Los cristales se crioprotegieron con PEG 400 al 30 % y los datos se recopilaron en la línea de luz MANACA (SIRIUS). Los datos se procesaron con XDS a través de Autoproc56,57. Los datos se escalaron usando Aimless a través de CCP458, y el reemplazo molecular se realizó con Phaser59, usando PDB 7MBG como plantilla. Las estadísticas de recopilación de datos están disponibles en la Tabla 2. Los datos se modelaron con Coot y se refinaron con Acedrg y Refmac52,60,61,62,63. Las figuras fueron hechas con ChimeraX, Pymol y BioRender.com. La densidad electrónica de esta estructura es visible en la Fig. 7 complementaria.

Para un experimento de confirmación con una configuración diferente, se llevó a cabo espectrometría de masas nativa utilizando un UHMR Q-Exactive de Orbitrap como se describió anteriormente64. Brevemente, las soluciones de analito se cambiaron con tampón en acetato de amonio 200 mM pH 7,4 (Sigma Aldrich) utilizando columnas de desalinización Zeba micro spin (7 kDa MWCO, Pierce). Se cargó una muestra que contenía 1-3 µL de analito (en acetato de amonio 200 mM) en capilares de vidrio revestidos de oro preparados internamente, estirados hasta un punto de ~1 µm. El capilar se polarizó entre 1,0 y 1,2 kV en relación con el capilar de metal calentado (100 °C) para generar iones positivos mediante ionización por nanoelectrospray. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en el modo de iones positivos utilizando los ajustes recomendados por los fabricantes para la detección de "baja m/z". Los siguientes parámetros se ajustaron manualmente: potencial de captura en la fuente: 20 – 50 V, 4 ms; Potencial HCD: 1 – 10 V; ajuste de presión: 8.5. Los espectros de masas nativos se visualizaron en QualBrowser (Thermo Fisher Scientific) y OriginPro 2021 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Los espectros M/z aquí y de ESI-TOF nativo se analizaron utilizando Masshunter B.07.00 (Agilent); ESIprot65 y usando una tabla de iones. Los estados de carga se asignaron manualmente. Los resultados de esta ejecución están disponibles en la Fig. 6 complementaria.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos asociados con este estudio están disponibles públicamente. Todas las películas recopiladas y las partículas pulidas utilizadas para la determinación de la estructura final están disponibles en el Archivo Público de Imágenes de Microscopía Electrónica (EMPIAR) con el código EMPIAR-10810. Los mapas Cryo-EM y los modelos estructurales están disponibles en Protein Data Bank (PDB) con el código 8EY2 y Electron Microscopy Data Bank (EMDB) con el código EMD-28666, y el modelo de rayos X está disponible con el código PDB 8EYJ. Las estructuras utilizadas en este estudio están disponibles en la base de datos PDB con los códigos 7N5Z, 7KPH, 7N6N, 7K3T y 7DVP. Con este documento se proporciona un archivo de datos de origen para todas las espectroscopias de masas nativas y SEC-MALS. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Wu, F. et al. Un nuevo coronavirus asociado con enfermedades respiratorias humanas en China. Naturaleza 579, 265–269 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, N. et al. Un nuevo coronavirus de pacientes con neumonía en China, 2019. N. Engl. J.Med. 382, 727–733 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bhat, PR et al. Base estructural del cambio de marco ribosómico durante la traducción del genoma del ARN del SARS-CoV-2. Ciencia 372, 1306–1313 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Osipiuk, J. et al. Estructura de la proteasa tipo papaína del SARS-CoV-2 y sus complejos con inhibidores no covalentes. Nat. común 12, 1–9 (2021).

Artículo Google Académico

Zhang, L. et al. La estructura cristalina de la proteasa principal del SARS-CoV-2 proporciona una base para el diseño de inhibidores de a-cetoamida mejorados. Ciencia 368, 409–412 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Noske, GD et al. Una instantánea cristalográfica del proceso de maduración de la proteasa principal del SARS-CoV-2. J. Mol. Biol. 433, 167118 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gordon, DE et al. Un mapa de interacción de proteínas SARS-CoV-2 revela objetivos para la reutilización de medicamentos. Naturaleza 583, 459–468 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chodera, J., Lee, AA, London, N. y von Delft, F. Descubrimiento de fármacos mediante crowdsourcing para pandemias. Nat. química 12, 581 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

von Delft, F. et al. Un viaje de nudillos blancos del descubrimiento abierto de fármacos COVID. Naturaleza 594, 330–332 (2021).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Owen, DR et al. Un candidato clínico inhibidor oral de SARS-CoV-2 Mpro para el tratamiento de COVID-19. Ciencia 374, 1586–1593 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

El consorcio COVID Moonshot et al. Descubrimiento de ciencia abierta de la terapéutica oral no covalente del inhibidor principal de la proteasa del SARS-CoV-2. Preimpresión en https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.29.339317v3 (2021).

Xia, B. & Kang, X. Activación y maduración de la proteasa principal del SARS-CoV. Protein Cell 2, 282–290 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsu, MF et al. Mecanismo del proceso de maduración de la proteasa SARS-CoV 3CL. J. Biol. química 280, 31257–31266 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Römer, RA, Römer, NS y Wallis, AK Flexibilidad y movilidad de las estructuras proteicas relacionadas con el SARS-CoV-2. ciencia Rep. 11, 1–13 (2021).

Artículo Google Académico

Zimmerman, MI y col. Las simulaciones de SARS-CoV-2 aumentan de escala para predecir la apertura de picos dramáticos y bolsas crípticas en el proteoma. Nat. química 13, 651–659 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, J. et al. Estructura cristalográfica del intermedio de acil-enzima de proteasa principal de SARS-CoV-2 de tipo salvaje con sitio de autoprocesamiento fisiológico C-terminal. Nat. común 11, 5877 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kneller, DW et al. Plasticidad estructural de la cavidad del sitio activo SARS-CoV-2 3CL Mpro revelada por cristalografía de rayos X a temperatura ambiente. Nat. común 11, 7–12 (2020).

Artículo Google Académico

Chen, H. et al. Solo un protómero es activo en el dímero de la proteinasa similar al SARS 3C. J. Biol. química 281, 13894–13898 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cho, E. et al. Perfilado dinámico de los sitios de unión al ligando de proteasa 3CL Mpro de β-coronavirus. J. Chem. información Modelo. 61, 3058–3073 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grottesi, A. et al. Estudios computacionales de SARS-CoV-2 3CLpro: conocimientos de MD Simulations. En t. J. Mol. ciencia 21, 1–18 (2020).

Artículo Google Académico

Macip, G. et al. La prisa genera desperdicio: una revisión crítica de la detección virtual basada en el acoplamiento en la reutilización de medicamentos para la inhibición de la proteasa principal (M-pro) del SARS-CoV-2. Medicina. Res. Rev. 42, 744–769 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Constant , DA , Mateo , R. , Nagamine , CM & Kirkegaard , K. Orientación de las escisiones intramoleculares de proteinasa NS2B/3 para la inhibición transdominante del virus del dengue . proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 115, 10136–10141 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jin, Z. et al. Estructura de Mpro de SARS-CoV-2 y descubrimiento de sus inhibidores. Naturaleza 582, 289–293 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Qiao, J. et al. Inhibidores de SARS-CoV-2 Mpro con actividad antiviral en un modelo de ratón transgénico. Ciencia 371, 1374–1378 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaidman, D. et al. Una tubería automática para el diseño de derivados irreversibles identifica un potente inhibidor de SARS-CoV-2 Mpro. Celúla. química Biol. 12, 1795–1806 (2021).

Artículo Google Académico

Han, SH et al. Optimización basada en la estructura de inhibidores no covalentes derivados de ML300 dirigidos a la proteasa 3CL del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2 3CLpro). J.Med. química 65, 2880–2904 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Dampalla, CS et al. Diseño guiado por la estructura de inhibidores de ciclohexano restringidos conformacionalmente del síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus-2 3CL Protease. J.Med. química 64, 10047–10058 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gunther, S. et al. El examen de rayos X identifica el sitio activo y los inhibidores alostéricos de la proteasa principal del SARS-CoV-2. Ciencia 372, 642–646 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, C. et al. Boceprevir, GC-376 y los inhibidores de calpaína II, XII inhiben la replicación viral del SARS-CoV-2 al atacar la proteasa viral principal. Celúla. Res. 30, 678–692 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Douangamath, A. et al. Detección de fragmentos cristalográficos y electrofílicos de la proteasa principal del SARS-CoV-2. Nat. común 11, 1–11 (2020).

Artículo Google Académico

Zhao, Y. et al. Base estructural para la escisión de la poliproteína replicasa y la especificidad del sustrato de la proteasa principal del SARS-CoV-2. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 119, e2117142119 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bai, B. et al. Ojivas peptidomiméticas de α-aciloximetilcetona con imitador de glutamina lactama P1 de seis miembros: inhibición de la proteasa 3CL del SARS-CoV-2, actividad antiviral del coronavirus y estabilidad biológica in vitro. J.Med. química 65, 2905–2925 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Kneller, DW et al. Sitio catalítico zwitteriónico inusual de la proteasa principal del SARS-CoV-2 revelado por cristalografía de neutrones. J. Biol. química 295, 17365–17373 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, S., Jonas, F., Shen, C. & Higenfeld, R. Liberación de la proteasa principal del SARS-CoV de la poliproteína viral: la autoescisión N-terminal no depende del modo de dimerización maduro. Protein Cell 1, 59–74 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, C. et al. Mecanismo de maduración de la proteinasa tipo 3C del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS). J. Biol. química 285, 28134–28140 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ho, BL et al. Evaluación crítica de los residuos importantes involucrados en la dimerización y catálisis de la proteasa principal del coronavirus MERS. PLoS One 10, e0144865 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Aslanidis, C. & de Jong, PJ Clonación independiente de la ligadura de productos de PCR (LIC-PCR). Ácidos Nucleicos Res. 18, 6069–6074 (1990).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Studier, FW Producción de proteínas por autoinducción en cultivos agitados de alta densidad. Expr. Proteína Purif. 41, 207–234 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wilkins, MR et al. Herramientas de identificación y análisis de proteínas en el servidor ExPASy. Métodos Mol. Biol. 112, 531–552 (1999).

CAS PubMed Google Académico

Zheng, SQ et al. MotionCor2: Corrección anisotrópica del movimiento inducido por haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J. et al. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. Elife 7, e42166 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

A, R. & N, G. CTFFIND4: Estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo Google Académico

Wagner, T. et al. SPHIRE-crYOLO es un selector de partículas totalmente automatizado rápido y preciso para crio-EM. común Biol. 2, 1–13 (2019).

Artículo Google Académico

J, Z., T, N. & SHW, S. Un enfoque bayesiano para la corrección del movimiento inducido por haz en el análisis de partículas individuales crio-EM. IUCrJ 6, 5–17 (2019).

Artículo Google Académico

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ y Brubaker, MA CryoSPARC: algoritmos para la determinación rápida de estructuras crio-EM sin supervisión. Nat. Métodos 14, 290–296 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Scheres, SHW y Chen, S. Prevención del sobreajuste en la determinación de la estructura crio-EM. Nat. Métodos 9, 853–854 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A., Zhang, H. & Fleet, DJ Refinamiento no uniforme: la regularización adaptativa mejora la reconstrucción crio-EM de una sola partícula. Nat. Métodos 17, 1214–1221 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tan, YZ et al. Abordar la orientación preferida de la muestra en crio-EM de una sola partícula a través de la inclinación. Nat. Métodos 14, 793–796 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

EF, P. et al. UCSF ChimeraX: visualización de estructuras para investigadores, educadores y desarrolladores. Ciencia de las proteínas 30, 70–82 (2021).

Artículo Google Académico

Terwilliger, TC, Sobolev, OV, Afonine, PV y Adams, PD Definición de mapas automatizada mediante la maximización de los detalles y la conectividad. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 74, 545–559 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afonine, PV et al. Refinamiento del espacio real en PHENIX para crio-EM y cristalografía. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 74, 531–544 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG y Cowtan, K. Características y desarrollo de Focha. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 66, 486–501 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Chen, VB et al. MolProbity: validación de estructuras de todos los átomos para cristalografía macromolecular. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 66, 12–21 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Punjani, A. & Fleet, DJ Análisis de variabilidad 3D: resolución de flexibilidad continua y heterogeneidad discreta a partir de crio-EM de una sola partícula. J. Estructura. Biol. 213, 107702 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chalk R. En Heterologous Gene Expression in E. coli: Methods and Protocols (ed. Burgess-Brown NA) 373–395 (Humana Press, ciudad de Nueva York, 2017).

Kabsch, W. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 66, 125–132 (2010). XDS.

Artículo CAS Google Académico

Vonrhein, C. et al. Procesamiento y análisis de datos con la caja de herramientas autoPROC. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 67, 293–302 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Winn, MD y col. Descripción general de la suite CCP4 y desarrollos actuales. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 67, 235–242 (2011).

Artículo CAS Google Académico

McCoy, AJ et al. Software cristalográfico Phaser. Aplicación J. cristalogr. 40, 658–674 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murshudov, GN et al. REFMAC5 para el refinamiento de estructuras cristalinas macromoleculares. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 67, 355–367 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Evans, PR & Murshudov, GN ¿Qué tan buenos son mis datos y cuál es la resolución? Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 69, 1204–1214 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Karplus, PA & Diederichs, K. Vinculación del modelo cristalográfico y la calidad de los datos. Ciencia 336, 1030–1033 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Largo, F. et al. AceDRG: un generador de descripción estereoquímica para ligandos. Acta Crystallogr. D. Estructura. Biol. 73, 112–122 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

El-Baba, TJ et al. Inhibición alostérica de la proteasa principal del SARS-CoV-2: conocimientos de ensayos basados en espectrometría de masas. Angew. química En t. ed. 59, 23544 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Winkler, R. ESIprot: una herramienta universal para la determinación del estado de carga y el cálculo del peso molecular de proteínas a partir de datos de espectrometría de masas de ionización por electrospray. Comun rápido. Misa SP 24, 285–294 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Los autores agradecen a Diamond Light Source por acceder y apoyar las instalaciones crio-EM en el Centro nacional de bioimagen de electrones (eBIC) del Reino Unido a través de la propuesta BI27083 y NT29349, financiada por Wellcome Trust, MRC y BBSRC. Los autores agradecen al Consorcio COVID Moonshot por el suministro del compuesto y al Prof. Carlos Alberto Montanari por el amable suministro de Nirmatrelvir. ASG reconoce a Andressa Patricia Alves Pinto por su apoyo con SEC-MALS. Este proyecto fue financiado por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES – Proyecto 88887.516153/2020-00, ASG) y la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (proyectos FAPESP 2013/07600-3, 2015/16811-3 y 2016/19712-9, GO). Este trabajo ha recibido el apoyo de la empresa conjunta EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 (subvención EUbOPEN n° 875510, RC). Esta investigación utilizó instalaciones del SIRIUS, parte del Centro Brasileño de Investigación en Energía y Materiales (CNPEM), una organización privada sin fines de lucro bajo la supervisión del Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovaciones de Brasil (MCTI). Se agradece al personal de la línea de luz MANACA por la asistencia durante los experimentos de la propuesta 20220605. La investigación informada en esta publicación fue financiada en parte por el NIAID del Instituto Nacional de Salud con el número de adjudicación U19AI171399. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Salud. La investigación en el laboratorio de Robinson cuenta con el apoyo de una subvención del programa del Consejo de Investigación Médica (MRC) (MR/V028839/1). Esta investigación también fue financiada en parte por Wellcome Trust, Grant No. 221795/Z/20/Z. TJE es un investigador junior en Linacre College y recibió el apoyo de una beca internacional de la Royal Society Newton. TJE y CVR agradecen el generoso apoyo brindado por el fondo de respuesta a la investigación COVID-19 de la Universidad de Oxford y sus donantes (BRD00230).

Estos autores contribuyeron por igual: Gabriela Dias Noske, Yun Song.

En la Información complementaria aparece una lista completa de los miembros y sus afiliaciones.

Instituto de Física de Sao Carlos, Universidad de Sao Paulo, Av. Joao Dagnone, 1100 - Jardim Santa Angelina, São Carlos, 13563-120, Brasil

Gabriela Dias Noske, Rafaela Sachetto Fernandes, Glaucius Oliva & André Schutzer Godoy

Centro de bioimagen de electrones, Diamond Light Source Ltd., campus de ciencia e innovación de Harwell, Didcot, OX11 0QX, Reino Unido

Yun Song y C.David Owen

Centro para el Descubrimiento de Medicamentos, Universidad de Oxford, OX1 3QU, Oxford, Reino Unido

Rod Chalk, Haitem Elmassoudi y Lizbé Koekemoer

Laboratorio de Química Física y Teórica, Departamento de Química, Universidad de Oxford, South Parks Road, OX1 3TA, Oxford, Reino Unido

Tarick J. El-Baba & Carol V. Robinson

Instituto Kavli para el descubrimiento de nanociencias, Dorothy Crowfoot Hodgkin Building, South Parks Road, OX1 3QU, Oxford, Reino Unido

Tarick J. El-Baba & Carol V. Robinson

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

ASG concibió este proyecto. GDN realizó experimentos bioquímicos y biofísicos. YS preparó cuadrículas y recopilación de datos. ASG y YS procesaron los datos crio-EM. ASG y GDN realizaron modelado y análisis. LK, HE, RC, THE y CVR realizaron experimentos de EM. ASG escribió y concibió este manuscrito. ASG, RSF, YS, CDO y GO revisaron este manuscrito.

Correspondencia a André Schutzer Godoy.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Jeffrey Agar, Stephen Harding y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Noske, GD, Song, Y., Fernandes, RS et al. Una instantánea en solución del proceso de maduración e inhibición de la proteasa principal del SARS-COV-2. Nat Comun 14, 1545 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37035-5

Descargar cita

Recibido: 01 Agosto 2022

Aceptado: 28 de febrero de 2023

Publicado: 20 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37035-5

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.