Estudio de Metabolómica Integrada de la Leche de Calor - Almacenamiento criogénico Co., Ltd de Chengdu

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 24208 (2016) Citar este artículo

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El estrés por calor (HS) daña la industria láctea mundial al reducir la producción y la calidad de la leche, perjudicar la salud y dañar la reproducción de las vacas lecheras, causando enormes pérdidas económicas cada año. Sin embargo, la comprensión del mecanismo fisiológico de las vacas lecheras lactantes con HS sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí, se realizó un estudio de metabolómica usando LC-MS y espectroscopía de 1H NMR para analizar las diferencias metabolómicas en la leche entre vacas lecheras libres de HS y con HS, y descubrir biomarcadores de diagnóstico y cambios en la vía metabólica. Un total de 53 metabolitos discriminantes se regularon significativamente hacia arriba o hacia abajo en el grupo con HS en comparación con el grupo sin HS (P < 0,05). Estos biomarcadores estaban involucrados en las vías del metabolismo derivado de carbohidratos, aminoácidos, lípidos y microbiomas intestinales. Al comparar estos biomarcadores potenciales con biomarcadores candidatos de HS previamente identificados en plasma, se encontraron correlaciones significativas entre los niveles de lactato, piruvato, creatina, acetona, β-hidroxibutirato, trimetilamina, ácido oleico, ácido linoleico, lisofosfatidilcolina 16:0 y fosfatidilcolina 42:2 en Se encontraron leche y plasma, lo que indica que la barrera sangre-leche se volvió permeable y los niveles de estos 10 biomarcadores en la leche pueden reflejar alteraciones metabolómicas inducidas por HS en la sangre. Estos nuevos hallazgos pueden respaldar una investigación más profunda para dilucidar los cambios basados en la leche en las vías metabólicas en vacas lecheras lactantes con HS.

Las vacas lecheras lactantes bajo estrés por calor (HS) experimentan una ingesta de energía limitada, porque no pueden satisfacer las demandas de sus cuerpos para producir leche y mantener la salud, lo que resulta en una producción y calidad de leche reducidas y deja a las vacas lecheras susceptibles a enfermedades1,2. Como resultado, se producen grandes pérdidas económicas en la industria láctea de muchos países, como China3,4, EE. UU.5 y Alemania6. Las alteraciones metabolómicas inducidas por el HS son directamente responsables de estas pérdidas1,7. Esto es particularmente importante dadas las tendencias de aumento de la productividad de la leche utilizando tecnologías genéticas moleculares modernas, acompañadas por los aumentos de temperatura derivados del cambio climático global8.

Una determinación precisa de cuándo las vacas ingresan a HS es complicada porque las respuestas a HS afectan no solo el balance de energía sino también el metabolismo del agua, sodio, potasio y cloro9. Aunque el índice de temperatura y humedad (THI) sigue siendo el indicador más común para HS, usar el valor THI de 72 como el umbral de inicio de HS10, solo permite juicios basados en la temperatura y humedad del aire, no es una medida precisa del metabolismo. alteraciones en las vacas lecheras bajo HS, y no tiene en cuenta los efectos específicos de la vaca (edad y raza) y otros factores ambientales. De hecho, los cambios fisiológicos inducidos por la HS en las vacas lecheras son multifactoriales7. Se necesitan biomarcadores de metabolitos robustos para diagnosticar el umbral de inicio de la HS, monitorear su progresión y proporcionar información sobre sus mecanismos fisiológicos, lo que permite la implementación de intervenciones oportunas para proteger a las vacas lecheras de enfermedades, como la cetosis.

Investigaciones anteriores sobre el rendimiento de las vacas lecheras se centraron en los cambios inducidos por el HS en su frecuencia respiratoria, frecuencia cardíaca, producción de leche, recuento de células somáticas y proteínas, grasas, lactosa, ácidos grasos no esterificados (FA) basales, insulina y tiroides. , noradrenalina, glucosa y niveles de nitrógeno ureico en plasma en la leche7,11. Sin embargo, pocos estudios han abordado los cambios globales en las rutas metabólicas y los mecanismos subyacentes a estos cambios siguen siendo desconocidos.

La metabolómica representa una poderosa plataforma para adquirir información de cientos de miles de metabolitos de bajo peso molecular en plantas, animales y humanos, y puede usarse para proporcionar una comprensión global de las alteraciones fisiopatológicas estimuladas por cambios ambientales12,13,14,15 . En el ganado lechero, la leche se puede recolectar de manera muy conveniente, brinda información sobre los cambios en los mecanismos de lactancia de las vacas lecheras y se puede analizar directamente para determinar su calidad nutricional. Por tanto, la leche se considera la muestra biológica ideal para el seguimiento de las alteraciones fisiológicas. En comparación con el muestreo de sangre, el muestreo de leche no es invasivo y se realiza a diario, por lo que los estados metabólicos de las vacas lecheras se pueden observar en tiempo real. Como resultado, se pueden monitorear las vacas y determinar su estado de HS, y se pueden implementar estrategias de manejo rápidas para reducir el impacto de HS. Por lo tanto, el presente estudio utilizó espectroscopía de LC-MS y 1H NMR para identificar diferencias metabólicas en la leche de vacas en lactancia media con y sin HS para identificar biomarcadores de HS y explorar las alteraciones en las vías metabólicas de vacas lecheras lactantes en diferentes estados de HS. También se utilizó LC-MS en modo de monitorización de reacción múltiple (MRM) para verificar la fiabilidad de los metabolitos discriminantes. Se realizaron análisis de correlación parcial de Pearson de los biomarcadores candidatos encontrados en la leche con los de la sangre16 para rastrear las causas de los metabolitos alterados en la leche. Las concentraciones de citocinas, proteína c reactiva y citocromo c se detectaron mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para obtener información sobre la inflamación y la apoptosis inducidas por HS. En general, los resultados de este estudio mejoran nuestra comprensión de las alteraciones metabólicas en vacas lecheras expuestas a HS. En la figura 1 se muestra una descripción general del diseño del estudio.

HS, estrés por calor; MTBE, metil terc-butil éter; RMN, resonancia magnética nuclear; MVDA, análisis de datos estadísticos multivariados; PCA, análisis de componentes principales; PLS-DA, análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales; OPLS-DA, análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales.

Los gráficos ortogonales de análisis discriminatorio de mínimos cuadrados parciales (OPLS-DA) de los datos metabolómicos mostraron una clara separación entre los grupos libres de HS y HS, sin ninguna superposición (Fig. 2A, B), lo que indica que el perfil metabólico se alteró significativamente en las muestras de leche HS. Los datos de RMN de 1H del suero y la grasa de la leche (Fig. 2A) y los datos de LC-MS del metaboloma de la leche (Fig. 2B) para los grupos sin HS y HS identificaron un componente predictivo y dos componentes ortogonales con modelado y predictivo satisfactorios. capacidades del 81,36% < R2 (Y) <88,2% y 63,9% < Q2 (cum) <86,1%. Para evitar el sobreajuste del modelo, se realizó una validación cruzada entre tres componentes con 999 pruebas de permutación aleatoria y se produjeron intersecciones de 0,015 < R2 < 0,239 y -0,275 < Q2 < -0,190 para todos los datos (Fig. 2C,D), lo que indica que el modelo fue válido16,17,18.

(A) Gráficos OPLS-DA de los datos de 1H NMR de suero y grasa de leche. (B) Gráficos OPLS-DA de los datos de LC-MS para el metaboloma de la leche. (C,D) Gráficos de validación de los modelos de análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) adquiridos a través de 999 pruebas de permutación para los datos de 1H NMR del suero y la grasa de la leche y los datos de LC-MS del metaboloma de la leche, respectivamente.

Al analizar los datos de RMN de 1H, identificamos un total de 25 candidatos metabólicos, que se muestran en la Tabla 1. Estos metabolitos eran carbohidratos, aminoácidos, lípidos y metabolitos derivados del microbioma intestinal, lo que sugiere que estas vías metabólicas estaban alteradas en el HS. grupo. La Figura 3 muestra un ejemplo de los espectros de RMN 1H de los metabolitos identificados a partir de la grasa láctea.

(A) FA, ácidos grasos. (B) TC, colesterol total. (C) UFA, ácidos grasos insaturados; TAG, triacilglicéridos. (D) AGPI, ácidos grasos poliinsaturados.

El análisis de los datos de LC-MS reveló que 119 metabolitos diferían entre los grupos sin HS y HS, con 33 de estos metabolitos restantes después de la eliminación de variables redundantes utilizando una combinación de cromatogramas de iones extraídos y la colección de algoritmos R-package para el perfil de metabolitos Anotación (CÁMARA)16,19. Para verificar estos 33 metabolitos, se realizó una detección confirmatoria usando LC-MS en modo MRM. Finalmente, se verificaron e identificaron 28 candidatos (Tabla 2). Con la excepción de la urea, los otros 27 compuestos eran metabolitos de lípidos, lo que indica que el metabolismo de los lípidos estaba alterado en el grupo de HS.

Los metabolitos identificados por 1H NMR que diferían entre los grupos con HS y sin HS se muestran en la Tabla 1, y se construyó un mapa de calor basado en las alteraciones en estos candidatos potenciales (Fig. 4A). Se observaron alteraciones inducidas por HS en los metabolitos relacionados con los carbohidratos para lactato, piruvato, galactosa-1-fosfato y citrato, cuyas concentraciones aumentaron de 1,27 a 1,79 veces en el grupo HS en comparación con el grupo libre de HS ( P < 0,002), con la excepción del fumarato disminuyó 0,78 veces en el grupo HS en comparación con el grupo sin HS (P < 0,001). Las concentraciones de isoleucina, prolina, orotato, glicina y fosfocreatina, que son metabolitos relacionados con proteínas o aminoácidos, cambiaron entre 0,69 y 0,88 veces en el grupo con HS en comparación con el grupo sin HS (p < 0,001). La creatina aumentó 1,59 veces en el grupo con HS en comparación con el grupo sin HS (P < 0,001). Las concentraciones de butirato, acetona, β-hidroxibutirato (BHBA), FA, PUFA y UFA, metabolitos relacionados con los lípidos, aumentaron entre 1,08 y 1,38 veces en el grupo con HS en comparación con el grupo sin HS (P < 0,02 ). Las concentraciones de N-acetil azúcar A, N-acetil azúcar B, N-acetil azúcar C, N-acetil azúcar D y TC cambiaron entre 0,68 y 0,91 veces en el grupo con HS en comparación con el grupo sin HS (P < 0,01 ). También se identificaron perturbaciones inducidas por HS del metabolismo derivado del microbioma intestinal, con concentraciones de trimetilamina (TMA) cambiadas 0,52 veces en el grupo HS en comparación con el grupo libre de HS (P < 0,001).

Representación de mapa de calor de la agrupación jerárquica no supervisada de (A) datos de 1H NMR y (B) datos de LC-MS de las muestras HS y sin HS. Los tonos de rojo y verde representan aumentos y disminuciones en la concentración de metabolitos, respectivamente, en relación con su nivel en el grupo libre de HS. Filas: metabolitos; columnas: muestras.

Los metabolitos identificados por LC-MS cambiados por HS se muestran en la Tabla 2, y se construyó un mapa de calor basado en las alteraciones en estos candidatos potenciales entre los grupos sin HS y HS (Fig. 4B). La mayoría de estos metabolitos son lípidos, y las concentraciones de ácido oleico, ácido linoleico y lisofosfatidilcolina (lysoPC) 16:0 cambiaron de 1,28 a 1,41 veces en el grupo con HS en comparación con el grupo sin HS (P < 0,005). y la fosfatidilcolina (PC), la esfingomielina (SM), el monoacilglicerol (MG), el diacilglicerol (DG) y el triradilglicerol (TG) cambiaron de 0,48 a 0,83 veces en el grupo con HS en comparación con el grupo sin HS (P < 0,02). La concentración de urea, que está relacionada con los aminoácidos, aumentó 1,32 veces en el grupo con HS en comparación con el grupo sin HS (P < 0,01).

La Tabla 3 enumera los coeficientes de correlación de los metabolitos candidatos en plasma y leche con correcciones para los grupos de tratamiento (HS y sin HS). Se observaron correlaciones significativas entre los niveles de lactato, piruvato, creatina, acetona, BHBA y TMA en plasma y en leche (P < 0,001). La importancia de las correlaciones para ácido oleico, ácido linoleico, lisoPC 16:0 y PC 42:2 fue inferior a 0,01. Además, también se detectaron correlaciones significativas entre los niveles de lactato y piruvato, y los niveles de acetona y BHBA en leche y plasma (P < 0,01).

La Tabla complementaria S6 enumera los cambios en las concentraciones de TNF-α, IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, proteína c reactiva, p53, Bax, Bcl-2, citocromo c, caspasa-3, caspasa -8 y caspasa-9 en plasma y leche de los grupos HS y libre de HS. Los niveles de todas estas proteínas fueron significativamente más altos en el grupo HS que en el grupo libre de HS (P < 0.05), con la excepción de que Bcl-2 e IL-12 fueron significativamente más bajos en el grupo HS que en el grupo HS- grupo libre (P < 0.05).

La tabla complementaria S7-S8 enumera los coeficientes de correlación entre la temperatura rectal y los niveles de metabolitos candidatos en plasma y leche, respectivamente. Se observaron correlaciones significativas entre los niveles plasmáticos de lactato, piruvato, creatina, prolina, lisina, glicina, treonina, isoleucina, leucina, ornitina, citrulina y arginina y la temperatura rectal (P < 0,01), así como entre lactato, niveles de piruvato, creatina y citrato en la leche y la temperatura rectal (P < 0,01). La Tabla complementaria S9 muestra los coeficientes de correlación para los niveles de citoquinas y metabolitos candidatos en plasma y leche. Se observaron correlaciones significativas entre p53, Bax, Bcl-2 y citocromo c y acetona y BHBA tanto en plasma como en leche (P < 0,01). La Tabla complementaria S10 enumera las correlaciones significativas entre los niveles de citocromo c y proteína c reactiva en plasma y leche (P < 0,01).

En el presente estudio, se identificaron 53 biomarcadores de metabolitos potenciales que podrían usarse para diagnosticar los estados de HS de las vacas lecheras lactantes. Estos biomarcadores potenciales estaban involucrados en las vías del metabolismo derivado de carbohidratos, aminoácidos, lípidos y microbiomas intestinales, lo que indica que estas vías metabólicas estaban influenciadas por la HS.

HS reguló al alza los niveles de piruvato y lactato en la leche de vacas lecheras HS en el presente estudio metabolómico, como se observó en nuestro estudio metabolómico anterior del plasma de vacas lecheras HS16. Los análisis de correlación (Tabla 3) de los niveles de piruvato o lactato en plasma y leche de vacas HS y libres de HS revelaron que las concentraciones plasmáticas de piruvato y lactato se correlacionaron significativamente con sus respectivas concentraciones en la leche, lo que indica que estos dos metabolitos se secretan directamente de la sangre a la leche a través de la glándula mamaria20.

La concentración de citrato de leche aumentó en el grupo HS en comparación con el grupo libre de HS. Esta especie se ha utilizado como biomarcador del balance energético en vacas lecheras y se correlaciona con la presencia de cuerpos cetónicos en la leche y la síntesis de AG de novo21. Debido a que el epitelio mamario es impermeable al citrato en ambas direcciones, los niveles de citrato en la leche reflejan una alteración inducida por HS en la función mamaria más que una alteración en el metabolismo general. Las diferencias insignificantes en los niveles de citrato en plasma entre los grupos con HS y sin HS observados en nuestro estudio anterior16 confirman aún más la hipótesis de que los niveles de citrato en la leche reflejan una alteración inducida por HS en la función mamaria en lugar de alteraciones en el metabolismo del citrato en sangre. La concentración reducida de fumarato en las muestras de leche HS puede haber sido causada por un metabolismo energético alterado y una función deteriorada del ciclo del ácido tricarboxílico22.

La lactosa es el azúcar predominante en la leche de la mayoría de las especies. El papel del metabolismo de la glucosa en la producción de leche es transportar la glucosa de la sangre a la glándula mamaria para la síntesis de lactosa y tiene una función vital en la producción de leche relacionada con la osmorregulación de la leche23,24. Aunque el presente estudio no identificó diferencias significativas en las concentraciones de lactosa en la leche entre los grupos HS y sin HS, la producción de leche del grupo HS se redujo considerablemente (Tabla complementaria S4) en relación con el grupo sin HS (P < 0,01) . Como resultado, los rendimientos de lactosa se redujeron, lo que sugiere que había menos glucosa en sangre disponible para las glándulas mamarias o que se interrumpió la síntesis de lactosa.

El aumento de la concentración de galactosa-1-fosfato en la leche probablemente se atribuyó a la fuga de este componente de las células epiteliales mamarias a la leche, posiblemente a través de la apoptosis celular, y parece depender en gran medida de los estados de equilibrio energético25. Un balance energético negativo (BEN) puede aumentar considerablemente el índice apoptótico en la glándula mamaria25. Las vacas lecheras HS se encuentran en un estado NEB, lo que puede haber causado el aumento de los niveles de galactosa-1-fosfato en la leche en el presente estudio. La disminución de los niveles de N-acetil azúcar A, N-acetil azúcar B, N-acetil azúcar C y N-acetil azúcar D en el grupo HS indicaron que HS alteró su síntesis al reducir los niveles de sus precursores o influir en las enzimas relacionadas.

Se detectaron concentraciones reducidas de isoleucina, prolina, orotato, glicina y fosfocreatina en las muestras de leche del grupo con HS en comparación con las del grupo sin HS. Sin embargo, las concentraciones de estos metabolitos aumentaron en el plasma de las vacas lecheras HS en nuestro estudio de metabolómica anterior16. Estos aminoácidos pueden ser los principales precursores de la producción de glucosa a través de la gluconeogénesis o la producción de energía a través de la desaminación y la oxidación26, posiblemente disminuyendo su distribución en la leche a través de la glándula mamaria. Dentro de la célula, los aminoácidos participan en reacciones metabólicas que producen, entre otros, CO2, urea, poliaminas y aminoácidos no esenciales (NEAA). El aumento de la concentración de urea en las muestras de plasma de vacas lecheras con HS indica que se metabolizaron más aminoácidos en urea que en proteínas de la leche dentro de las células de la glándula mamaria. La temperatura rectal se correlacionó significativamente con los niveles de prolina, lisina, creatinina, treonina, isoleucina, leucina, ornitina, citrulina, arginina y creatina en plasma (Tabla complementaria S7), lo que sugiere que HS aumentó el catabolismo de la proteína del músculo esquelético en amino ácidos en plasma27. Se observaron correlaciones significativas entre la temperatura rectal y los niveles de lactato y piruvato tanto en plasma como en leche (Tabla complementaria S8), lo que indica una mayor glucólisis anaeróbica.

En vacas lactantes, el NEB está asociado con la movilización de las reservas de energía del cuerpo, lo que conduce a una lipólisis prolongada del tejido adiposo y a la partición de AG no esterificados en el torrente sanguíneo25. Esta partición influirá en el perfil de AG en el suero de la leche, por ejemplo, aumentando las concentraciones de AG insaturados (UFA), principalmente C18:1 (ácido oleico) y C18:2 (ácido linoleico). La misma tendencia también se observó en nuestros resultados para la composición de grasa de la leche, que mostró una mayor concentración de UFA y AG poliinsaturados (PUFA) en la leche de las vacas del grupo HS. En vacas, la presencia de UFA se ha relacionado con enfermedades inflamatorias, como mastitis y metritis. El colesterol se transporta por todo el cuerpo a través de partículas de lipoproteínas. Un estudio previo en el plasma de vacas lecheras lactantes bajo HS mostró que HS redujo las concentraciones de lipoproteínas de alta densidad (HDL) y lipoproteínas de muy baja densidad/lipoproteínas de baja densidad (VLDL/LDL), disminuyendo su aporte al tejido mamario. celdas16. La concentración de colesterol en la grasa de la leche fue menor en el grupo HS que en el grupo libre de HS, lo que indica que la síntesis y el transporte de colesterol a la leche están limitados bajo HS.

Las concentraciones de BHBA y acetona aumentaron significativamente en el grupo de HS en comparación con el grupo sin HS. Estos cambios coincidieron con nuestro estudio previo de metabolómica plasmática de vacas lecheras con HS16. El análisis de correlación parcial reveló que las concentraciones de BHBA y acetona en la leche de vacas lecheras lactantes en los estados HS y libres de HS se correlacionaron significativamente con sus concentraciones plasmáticas informadas en un estudio anterior (P < 0.01)16, lo que indica que el BHBA y la acetona en la sangre pasó sin cambios a la leche a través de las células mamarias. Por lo tanto, concentraciones elevadas de BHBA y acetona en la leche pueden indicar un aumento de los niveles de BHBA y acetona en sangre, que son marcadores bien conocidos del estado energético de las vacas lecheras y reflejan una movilización excesiva de proteínas y un suministro insuficiente de glucosa21.

Se detectaron proteínas P53 aumentadas, Bax, citocromo c, caspasa-3, caspasa-8, caspasa-9 y Bcl-2 disminuidas, todas ellas moléculas relacionadas con la apoptosis28, tanto en plasma como en leche del grupo HS. El aumento de la proteína P53 puede facilitar la biosíntesis de proteínas de enrutamiento para la apoptosis. El equilibrio de la relación Bcl-2 y Bax actúa como un importante regulador de la respuesta mitocondrial a las señales apoptóticas, y su desequilibrio puede conducir a la liberación de citocromo c, lo que predice la apoptosis celular. La activación de cizallamiento de caspasa-8 puede iniciar la reacción en cascada de caspasa. La caspasa-3 y la caspasa-9 se consideran ejecutoras e iniciadoras de la apoptosis, respectivamente. Las concentraciones de BHBA y acetona se correlacionaron significativamente con la proteína P53, Bax, Bcl-2 y el citocromo c tanto en plasma como en leche (Tabla complementaria S9), lo que sugiere que el NEB aumentó la apoptosis29.

Las concentraciones de PC, incluyendo PC 40:1, PC 40:0, PC 42:2, PC 44:3 y PC 44:1, fueron menores en el grupo HS que en el grupo libre de HS, mientras que las concentraciones de lysoPC 16:0 fueron más altos en el grupo HS que en el grupo libre de HS. Las LysoPC son metabolitos del catabolismo de la PC, que está regulado por las fosfolipasas A1, A2 y D30,31. Las alteraciones observadas en las concentraciones de PC y lisoPC fueron consistentes con nuestro estudio previo de metabolómica plasmática de vacas lecheras con HS16. Otros metabolitos relacionados con los lípidos en la leche, como SM, MG, DG y TG, también estaban regulados a la baja en el grupo de HS. En conjunto, estos hallazgos muestran claramente que la HS induce alteraciones generales en el metabolismo de los lípidos tanto en la sangre como en la leche de las vacas lecheras lactantes.

Hubo una fuerte correlación entre los niveles de TMA en leche y plasma, lo que indica que las alteraciones en los niveles de TMA en plasma16 influyeron en su concentración en la leche (Tabla 3). Encontramos que HS causó una marcada reducción en los niveles de TMA en leche en vacas HS en comparación con las vacas libres de HS (Tabla 1). Esto nos lleva a creer que el HS indujo variaciones en el número y/o actividad de los microbios intestinales.

La función inmunológica de las vacas puede verse afectada por HS32. El aumento de proteína c reactiva, TNF-α, IL-2, IL-10, IL-15 y la disminución de IL-12 tanto en el plasma como en la leche del grupo HS se consideran una respuesta a la inflamación inducida por HS29,33,34 , lo que confirma el deterioro del sistema inmunológico en el grupo HS. Los niveles plasmáticos de citocromo c y proteína c reactiva se correlacionaron significativamente con sus respectivas concentraciones en la leche (Tabla complementaria S10), lo que sugiere que el HS indujo una respuesta inflamatoria en todo el cuerpo de las vacas lecheras33. Durante una respuesta inmune mamaria, la barrera sangre-leche se ve comprometida35. Por lo tanto, nuestra regulación hacia arriba o hacia abajo previamente informada de los niveles de lactato, piruvato, creatina, acetona, BHBA, TMA, ácido oleico, ácido linoleico, lisoPC 16:0 y PC 42:2 en el plasma16 también se observó en la leche. en el presente estudio (Tabla 3). Aunque los niveles de estos 10 biomarcadores candidatos en la leche se correlacionaron significativamente con sus respectivas concentraciones en la sangre, los 43 biomarcadores potenciales restantes (Tablas 1 y 2) en la leche no mostraron correlaciones similares, lo que indica que los 10 biomarcadores anteriores pueden reflejar la hipersensibilidad inducida por HS. perturbaciones en los metabolitos de la sangre, mientras que los 43 restantes reflejan una función mamaria alterada en lugar de alteraciones metabólicas generales.

Debido a que los niveles de los biomarcadores candidatos lactato, piruvato, creatina, acetona, BHBA, TMA, ácido oleico, ácido linoleico, lisoPC 16:0 y PC 42:2 en la leche mostraron fuertes correlaciones con sus respectivas concentraciones en la sangre de HS- vacas lecheras libres y con HS, la detección de estos metabolitos de la leche puede diagnosticar estados de HS y perturbaciones inducidas por HS en el metabolismo general. Otros biomarcadores potenciales pueden reflejar alteraciones inducidas por HS en la función mamaria de vacas lecheras con HS. Los resultados identifican biomarcadores potenciales que podrían usarse para monitorear con precisión los estados de HS de las vacas lecheras lactantes y merecen una mayor investigación para dilucidar los mecanismos fisiológicos que subyacen a los cambios inducidos por HS en las vías metabólicas. Esto podría conducir a mejores prácticas de manejo para vacas lecheras expuestas a HS.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los principios del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Academia China de Ciencias Agrícolas (Beijing, China), que aprobó los protocolos de estudio.

El óxido de deuterio y el cloroformo deuterado se adquirieron de USA Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Tewksbury, MA, USA); y la sal sódica del ácido 3-(trimetilsilil)propiónico-2,2,3,3,d4 propiónico se adquirió de Merck Canada Inc. (Kirkland, QC, Canadá). El metanol de grado HPLC, el metil terc-butil éter, el agua, el ácido fórmico y el formiato de amonio se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania).

Según NRC (1971), THI se calculó mediante la fórmula: THI = (1,8 × Tdb + 32) −[(0,55−0,0055 × RH) × (1,8 × Tdb −26,8)], donde Tdb es la temperatura de bulbo seco (°C) y HR es la humedad relativa (%). En este ensayo se utilizaron cuarenta y cuatro vacas Holstein en segundo parto a mitad de la lactancia que fueron alimentadas con la misma dieta. El grupo libre de HS consistió en 22 vacas, con muestras de leche obtenidas en la temporada de primavera bajo un THI de 50–55 durante un mes. El grupo HS consistió en 22 vacas, con muestras obtenidas en la temporada de verano, luego de que el THI aumentara gradualmente de 68 a 80 durante 1 mes y se mantuviera estable en 80 durante 1 semana. Las muestras de leche de la mañana se recogieron antes de la alimentación y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. Las características detalladas de las vacas lecheras seleccionadas, la composición del alimento, la temperatura, la humedad, la temperatura rectal, la tasa de respiración y las características de producción de los dos grupos de vacas lecheras se muestran en la Tabla complementaria S1–S4 con referencia al documento informado16.

Las muestras de leche se descongelaron a temperatura ambiente, se homogeneizaron y se centrifugaron a 20000 g durante 30 min a 4 °C. Todas las muestras se analizaron a 298 K con un ESPECTRÓMETRO DE RMN VARIAN VNMRS de 600 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA) que funciona a 599,871 MHz con una sonda de triple resonancia de protones inversos (HX) de 5 mm con bobina de gradiente en el eje z . Los espectros de RMN de 1H del suero de leche se registraron utilizando la secuencia de pulsos CPMG 1D estándar con supresión de agua (RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ), donde un retraso total fijo de relajación de espín-espín de 2nτ de Se aplicaron 320 ms para atenuar las señales amplias de RMN de las moléculas que giran lentamente (como las proteínas) y retener las de los compuestos de bajo peso molecular y algunos componentes lipídicos36. Los decaimientos de inducción libre (FID) se recolectaron a través de puntos de datos de 64 K con un ancho espectral de 12000 Hz y 128 escaneos. Los FID se llenaron con ceros para duplicar su tamaño y se multiplicaron por un factor de ampliación de línea exponencial de 0,5 Hz antes de la transformación de Fourier (FT). Los espectros de RMN 1H de la grasa de la leche no requieren la presaturación de la resonancia del agua. Aquí, usamos una secuencia simple de adquisición de pulsos 901 porque estábamos midiendo espectros completamente relajados. Recolectamos 64 transitorios en 32,768 puntos de datos; los otros parámetros fueron los siguientes: retardo de relajación = 2 s, ancho espectral = 20 ppm y tiempo de adquisición = 1,36 s. Los metabolitos se identificaron insertando los espectros experimentales en la base de datos espectral Chenomx (Edmonton, AB, Canadá) y comparándolos con los espectros de los compuestos estándar.

Cincuenta microlitros (50 μL) de leche se mezclaron con 350 μL de solventes compuestos por metanol y metil terc-butil éter (MTBE) en una proporción de 1:1 (v:v), y se agregó acetato de vitamina E como estándar interno ( IS), a una concentración final de 25 ppm. La solución se filtró a través de una placa de filtración de 96 pocillos Captiva (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los análisis LC-MS/MS se realizaron utilizando el sistema 20ADXR ultrarrápido LC (UFLC) de Shimadzu y un espectrómetro de masas 5600 Triple TOF (Applied Biosystems/MDS Sciex, Concord, ON, Canadá). Se inyectaron cinco microlitros (5 μL) de muestras preparadas en una columna a 40 °C (columna ACQUITY UPLC HSS T3 de 1,8 μm, 2,1 × 100 mm, Waters, Dublín, Irlanda). La temperatura del automuestreador se mantuvo a 15 °C. El gradiente consistió en la fase móvil A (formato de amonio 10 mM en agua) y la fase móvil B (formato de amonio 10 mM en metanol) bombeada a 0,3 ml/min en un tiempo total de ejecución de 33 min. Los gradientes lineales fueron: 70 % B a 1 min, 99 % B a los 15 min, 99 % B a los 20 min, 1 % B a los 20,1 min y 1 % B a los 33 min. La fuente de ionización por electropulverización (ESI) se configuró en modo de ionización positiva. Los parámetros de MS para la detección fueron los siguientes: tensión de fuente ESI 5,5 kV; temperatura del vaporizador, 550 °C; presión de gas de secado (N2), 60 psi; presión de gas nebulizador (N2), 60 psi; presión de gas de cortina (N2), 30 psi; y potencial de desagrupamiento, 50 V. El rango de escaneo fue m/z 60–1,000. La adquisición y el procesamiento de datos se realizaron con el software Analyst® TF 1.6 (Applied Biosystems/MDS Sciex). La calibración automática se realizó utilizando el sistema de suministro de calibradores en los modos de iones positivos y negativos. Los metabolitos se identificaron utilizando el modo de adquisición dependiente de la información en los análisis MS/MS. La energía de colisión fue de 35 eV. Se emplearon MS de alta resolución, índices de abundancia de isótopos, MS/MS, la base de datos Human Metabolome, la base de datos METLIN37, una búsqueda bibliográfica y comparaciones con estándares para identificar las estructuras iónicas. Las muestras de control de calidad (QC) se detectaron una vez cada 10 ciclos de LC-MS para controlar la reproducibilidad del instrumento. Las muestras de plasma de los diferentes grupos se alternaron aleatoriamente durante el análisis. La calibración automática se realizó utilizando el sistema de suministro de calibradores en los modos de iones positivos y negativos.

Los espectros de RMN de 1H sin procesar se corrigieron manualmente para las distorsiones de fase y línea de base utilizando el software TopSpin (versión 3.0; BrukerBiospin) y se referenciaron a la resonancia de doblete anomérico de lactosa (δ 5,233 ppm) para los espectros de suero de leche y el 3-(trimetilsilil) propiónico. Señal de sal sódica del ácido -2,2,3,3,d4 (δ 0,0 ppm) para los espectros de grasa de la leche. Los espectros de RMN de 1H de todas las muestras se agruparon en regiones integrales de 0,001 ppm y se integraron en la región de 0,5 a 7,0 ppm con exclusión de agua (δ 4,7 a 5,12) mediante el paquete de software AMIX (versión 3.8.3, BrukerBiospin). Los espectros se normalizaron a la suma total de las integrales espectrales para compensar las diferencias en las concentraciones de la muestra. Las matrices de datos bidimensionales de los datos de suero y grasa de la leche se integraron en un archivo de Excel para el posterior análisis SIMCA-P.

Los archivos de datos de LC-MS sin procesar (.wiff) se convirtieron al formato mzXML utilizando ProteoWizard (http://metlin.scripps.edu/xcms/download/pwiz/pwiz.zip). Los archivos se procesaron utilizando un paquete XCMS de código abierto (versión 1.20.1) en el software estadístico R (versión 2.10.0) para la discriminación, el filtrado y la alineación de picos38. Durante la implementación de XCMS, se utilizó la CÁMARA del paquete R para anotar los picos de isótopos, aductos e iones de productos. Las matrices bidimensionales resultantes, incluidas las observaciones (nombres de muestra) en columnas, las variables (pares de tiempo de retención m/z) en filas y las áreas de pico, se guardaron como archivos CSV. El SI se utilizó para el control de calidad de los datos (reproducibilidad) y la normalización.

Los conjuntos de datos resultantes luego se importaron al paquete de software SIMCA-P 13.0 (Umetrics AB, Umeå, Suecia); Se aplicaron escalas de Pareto y del centro a los datos de LC-MS y 1H NMR, respectivamente, para reducir el ruido y los artefactos en los modelos. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) en los datos escalados para visualizar las tendencias globales de agrupamiento y separación o valores atípicos. Se aplicaron modelos PLS-DA para validar el modelo contra el sobreajuste a través de 999 pruebas de permutación aleatoria. Las variables discriminantes se seleccionaron de acuerdo con los gráficos S, la importancia de la variable en los valores de proyección (VIP > 1) y los gráficos de datos sin procesar en los modelos OPLS-DA16,17,18. Además, se utilizaron pruebas t independientes (P < 0,05) (SPSS versión 13.0) para determinar la importancia de cada metabolito en la discriminación del grupo con HS de los grupos sin HS.

Para analizar las correlaciones entre los niveles de todos los biomarcadores potenciales descubiertos en la leche con sus respectivas concentraciones en plasma informadas previamente de muestras recolectadas al mismo tiempo, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson parciales en dos niveles de confianza (0,01 y 0,001) mediante la corrección de la Grupo HS en primer orden utilizando el programa informático ParCorA, que se puede descargar en http://mendes.vbi.vt.edu/tiki-index.php?page. Cluster 3.0 y Treeview se usaron por separado para el análisis y la visualización de grupos, respectivamente.

Las condiciones de elución del gradiente cromatográfico no cambiaron. El eluyente se inyectó en un espectrómetro de masas con trampa de triple cuadrupolo equipado con una fuente ESI (QTRAP 5500, Applied Biosystems/MDS Sciex). Todos los candidatos potenciales descubiertos por LC-MS fueron detectados por UFLC-MS/MS en modo MRM. Para cada analito de interés, las energías de colisión y los pares de iones precursor/fragmento se optimizaron previamente para generar una relación señal/ruido óptima. Las transiciones de MRM se enumeran en la Tabla complementaria S1.

Las concentraciones de citocinas, proteína c reactiva y citocromo c tanto en plasma como en leche se analizaron utilizando kits ELISA específicos para bovino disponibles comercialmente (Abcam®, Cambridge, MA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cómo citar este artículo: Tian, H. et al. Estudio integrado de metabolómica de la leche de vacas lecheras lactantes estresadas por calor. ciencia Rep. 6, 24208; doi: 10.1038/srep24208 (2016).

Bernabucci, U. et al. Los efectos del estrés por calor en el ganado lechero Holstein italiano. J. Ciencias de la leche. 97, 471–486 (2014).

Artículo CAS Google Académico

West, JW Efectos del estrés por calor en la producción de ganado lechero. J. Lácteos. ciencia 86, 2131–2144 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Wang, JP et al. Efecto de la suplementación con ácidos grasos saturados en los índices de producción y metabolismo en vacas lecheras con estrés por calor en la mitad de la lactancia. J. Ciencias de la leche. 93, 4121–4127 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Cheng, JB et al. El cambio de período natural del estrés por calor revela un "síndrome de disminución de la proteína de la leche por estrés por calor" único en vacas lecheras en lactancia media. Cría de animales y medicina veterinaria de China 41, 73–84 (2014).

CAS Google Académico

St-Pierre, NR, Cobanov, B. & Schnitkey, G. Pérdidas económicas por estrés térmico en las industrias ganaderas de EE. UU. J. Ciencias de la leche. 86, E52–E77 (2003).

Artículo Google Académico

Schüller, LK, Burfeind, O. & Heuwieser, W. Impacto del estrés por calor en la tasa de concepción de vacas lecheras en clima moderado considerando diferentes umbrales de índice de temperatura-humedad, períodos relativos a la reproducción e índices de carga de calor. Teriogenología 81, 1050–1057 (2014).

Artículo Google Académico

Wheelock, JB, Rhoads, RP, Vanbaale, MJ, Sanders, SR & Baumgard, LH Efectos del estrés por calor en el metabolismo energético en vacas Holstein lactantes. J. Ciencias de la leche. 93, 644–655 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Key, N. & Sneeringer, S. Efectos potenciales del cambio climático en la productividad de las lecherías estadounidenses. Amer. J. Agr. economía 1-21 (2014).

Sevi, A. et al. Efectos de la radiación solar y el tiempo de alimentación sobre el comportamiento, la respuesta inmune y la producción de ovejas lactantes bajo temperatura ambiente alta. J. Ciencias de la leche. 84, 629–40 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Hammami, H., Bormann, J., M'hamdi, N., Montaldo, HH y Gengler, N. Evaluación de los efectos del estrés por calor en los rasgos de producción y la puntuación de células somáticas de Holstein en un ambiente templado. J. Ciencias de la leche. 96, 1844–1855 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Vernon, RG Efectos de la dieta sobre la lipólisis y su regulación. proc. Nutrición Soc. 51, 397–408 (1992).

Artículo CAS Google Académico

Sreekumar, A. et al. Los perfiles metabolómicos delinean el papel potencial de la sarcosina en la progresión del cáncer de próstata. Naturaleza 457, 910–914 (2009).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Nie, W. et al. Tecnologías multiómicas avanzadas basadas en espectrometría de masas para explorar la patogenia del carcinoma hepatocelular. Espectro de masas Rev. 2, doi: 10.1002/mas.21439. [Epub antes de la impresión] (2014).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Tian, Y. et al. La metabolómica integrativa como método potencial para el diagnóstico de neoplasias tiroideas malignas. ciencia Rep. 21, 14869 (2015).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Zhao, Y. et al. Un estudio de metabolómica que delinea los cambios metabólicos primarios asociados con la ubicación geográfica en las hojas de las plantas de tabaco en crecimiento mediante GC-MS y CE-MS. ciencia Rep. 9, 16346 (2015).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Tian, H. et al. Identificación de biomarcadores de diagnóstico y cambios en la ruta metabólica de vacas lecheras lactantes con estrés por calor. J. Proteómica 125, 17–28 (2015).

Artículo CAS Google Académico

An, Z. et al. Enfoque de ionización integrada para metabolómica basada en RRLC-MS/MS: búsqueda de biomarcadores potenciales para el cáncer de pulmón. J. Proteoma Res. 8, 4071–4081 (2010).

Artículo Google Académico

Li, T. et al. Descubrimiento de biomarcadores in situ y diagnóstico histopatológico molecular sin etiquetas de cáncer de pulmón mediante imágenes de espectrometría de masas ambiental. ciencia Rep. 5, 14089 (2015).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Tian, H. et al. Análisis del metaboloma plasmático mediante cromatografía líquida de resolución rápida de ionización integrada/espectrometría de masas en tándem. Comun rápido. espectro de masas. 27, 2071–2080 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Lehmann, M., Wellnitz, O. & Bruckmaier, RM Transferencia concomitante inducida por lipopolisacáridos de componentes derivados de la sangre, incluidas las inmunoglobulinas, a la leche. J. Ciencias de la leche. 96, 889–896 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Klein, MS et al. Correlaciones entre la leche y los niveles plasmáticos de aminoácidos y ácidos carboxílicos en vacas lecheras. J. Proteoma Res. 12, 5223–5232 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Sundekilde, Reino Unido, Poulsen, NA, Larsen, LB & Bertram, HC La metabolómica de resonancia magnética nuclear revela una fuerte asociación entre los metabolitos de la leche y el recuento de células somáticas en la leche bovina. J. Ciencias de la leche. 96, 290–299 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Eger, M. et al. La expresión del transportador de glucosa difiere entre los subconjuntos de monocitos y macrófagos bovinos y está influenciada por la producción de leche. J ciencia lechera. 99, 2276–2287 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Osorio, JS, Lohakare, J. & Bionaz, M. Biosíntesis de grasa, proteína y lactosa de la leche: funciones de la regulación transcripcional y postranscripcional. Physiol Genómica. 2016 26 de enero: fisiolgenomics.00016. doi: 10.1152/fisiolgenomics.00016.2015. [Epub antes de la impresión] (2015).

Artículo CAS Google Académico

Lu, J. et al. Cambios en el proteoma y metaboloma de la leche asociados con la duración del período seco, el balance energético y la etapa de lactancia en vacas lecheras posparto. J. Proteoma Res. 12, 3288–3296 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Li, LO et al. El metabolismo compartimentado de acil-CoA en el músculo esquelético regula la homeostasis sistémica de la glucosa. Diabetes 64, 23–25 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Wheelock, JB, Rhoads, RP, Vanbaale, MJ, Sanders, SR & Baumgard, LH Efectos del estrés por calor en el metabolismo energético en vacas Holstein lactantes. J ciencia lechera. 93, 644–655 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Cheng, CH et al. Las altas temperaturas inducen la apoptosis y el estrés oxidativo en las células sanguíneas del pez globo (Takifugu obscurus). J Therm Biol. 53, 172–179 (2015).

Artículo Google Académico

Morris, DG et al. Efectos pleiotrópicos del balance energético negativo en la vaca lechera posparto sobre la expresión del gen esplénico: repercusiones para la inmunidad innata y adaptativa. Physiol Genomics 39, 28–37 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Dong, J. et al. Perfil de lisofosfatidilcolina de plasma: discriminación de isómeros y descubrimiento de biomarcadores de cáncer de pulmón. Metabolómica 6, 478–448 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Glunde, K. & Serkova, NJ Objetivos terapéuticos y biomarcadores identificados en el metabolismo de los fosfolípidos de colina del cáncer. Farmacogenómica 7, 1109–1123 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Tao, S. et al. Efecto del estrés por calor durante el período seco en el desarrollo de la glándula mamaria. J. Ciencias de la leche. 94, 5976–5986 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Kaldur, T. et al. Efectos de la aclimatación al calor sobre los cambios en el estrés oxidativo y la inflamación causados por la prueba de capacidad de resistencia en el calor. Oxid Med Cell Longev. 2014, 107137 (2014).

Artículo Google Académico

Caroprese, M., Albenzio, M., Marino, R., Santillo, A. y Sevi, A. La glutamina dietética mejora las respuestas inmunitarias de las vacas lecheras a temperatura ambiente alta. J ciencia lechera. 96, 3002–3011 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Beckonert, O. et al. Perfiles metabólicos, procedimientos metabolómicos y metabonómicos para espectroscopía de RMN de extractos de orina, plasma, suero y tejidos. Nat. Protocolo 2, 2692–2703 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Zhu, ZJ et al. Caracterización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo por cromatografía líquida de metabolitos guiada por la base de datos METLIN. Nat. Protocolo 8, 451–460 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Smith, CA, Want, EJ, O'Maille, G., Abagyan, R. y Siuzdak, G. XCMS: procesamiento de datos de espectrometría de masas para el perfilado de metabolitos mediante alineación, coincidencia e identificación de picos no lineales. Anal. química 78, 779–787 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación Básica Clave de China (Beijing, China; 2011CB100805), por el Programa de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola (ASTIP-IAS12), por el Sistema de Investigación de la RP China (nycytx-04-01) , y por el Proyecto Financiado por la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (Beijing, China; 2014M550907).

He Tian, Nan Zheng y Weiyu Wang: estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

Instituto de Ciencia Animal, Academia China de Ciencias Agrícolas, Beijing, 100193, PR China

He Tian, Nan Zheng, Songli Li, Yangdong Zhang y Jiaqi Wang

La escuela secundaria afiliada a la Universidad Renmin de China, Beijing, 100080, PR China

weiyu wang

Facultad de Ciencia y Tecnología Animal, Universidad Agrícola de Anhui, Hefei, 230036, República Popular China

Jianbo Cheng

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JW diseñó y supervisó todo el estudio. JW, HT, NZ y WW planificaron los experimentos; JC, SL e YZ seleccionaron vacas lecheras, recolectaron y proporcionaron muestras de leche. HT realizó el análisis NMR y LC-MS, la extracción de datos y escribió el manuscrito. JW revisó el manuscrito. JW, HT, NZ y WW aclararon las implicaciones de los resultados.

Correspondencia a Jiaqi Wang.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Tian, H., Zheng, N., Wang, W. et al. Estudio integrado de metabolómica de la leche de vacas lecheras lactantes estresadas por calor. Informe científico 6, 24208 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24208

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Recibido: 13 enero 2016

Aceptado: 22 de marzo de 2016

Publicado: 06 abril 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24208

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