Identificación de antibióticos en función de las diferencias estructurales en la alosteria conservada del hemo mitocondrial

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 7591 (2022) Citar este artículo

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La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es un problema de salud mundial. A pesar de los enormes esfuerzos realizados en la última década, las amenazas de algunas especies, incluida la Neisseria gonorrhoeae resistente a los medicamentos, continúan aumentando y se volverían intratables. Se requiere seriamente el desarrollo de antibióticos con un mecanismo de acción diferente. Aquí, identificamos un sitio inhibidor alostérico enterrado dentro de las hemo-cobre oxidasas (HCO) mitocondriales eucariotas, las enzimas respiratorias esenciales para la vida. La conformación estérica alrededor del bolsillo de unión de los HCO está muy conservada entre las bacterias y los eucariotas, aunque estos últimos tienen una hélice extra. Esta diferencia estructural en la alosteria conservada nos permitió identificar racionalmente los inhibidores bacterianos específicos de HCO: un compuesto antibiótico contra Neisseria gonorrhoeae resistente a la ceftriaxona. La dinámica molecular combinada con la espectroscopia de resonancia Raman y la espectroscopia de flujo detenido revelaron una obstrucción alostérica en el canal de acceso al sustrato como mecanismo de inhibición. Nuestro enfoque abre nuevos caminos en la modulación de las funciones de las proteínas y amplía nuestras opciones para superar la AMR.

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es un problema de salud mundial1. Se han hecho muchos esfuerzos para reducir la carga de los peligros de la RAM en todo el mundo desde 2013, pero las amenazas de algunas especies siguen aumentando a pesar de todo: la Neisseria gonorrhoeae resistente a los medicamentos es una de las cinco amenazas urgentes2,3. La resistencia a la ceftriaxona, la última opción como antibiótico empírico de primera línea contra Neisseria gonorrhoeae en la mayoría de los países, ha sido reportada y continúa surgiendo a nivel mundial4. La infección gonocócica podría volverse intratable debido a un alto grado de RAM, lo que aumentaría las complicaciones graves: infertilidad, embarazo ectópico y aumento de la transmisión del VIH. La aparición de patógenos resistentes a los antibióticos actualmente disponibles es muy alarmante; por lo tanto, el desarrollo de opciones de tratamiento es imperativo para abordar la RAM.

La cadena respiratoria ha atraído recientemente una atención científica considerable como un objetivo potencial para los antibióticos. Como arma para superar la RAM, se han aprobado o ingresado en ensayos clínicos compuestos dirigidos a la cadena respiratoria, por ejemplo, medicamentos contra parásitos, hongos y, en particular, Mycobacterium tuberculosis resistente a los medicamentos5,6,7,8,9,10. Sin embargo, la mayoría de ellos son inhibidores competitivos de los sitios ortostéricos. Como las enzimas respiratorias son esenciales para la vida, su estructura central generalmente se conserva en todas las especies. La similitud estructural y la similitud del sustrato con las proteínas del huésped son riesgos de reactividad cruzada, lo que podría ser una causa de efectos secundarios11. Por lo tanto, un inhibidor alostérico es una opción más factible ya que los sitios alostéricos están evolutivamente menos conservados en la secuencia de aminoácidos que los sitios ortostéricos, lo que teóricamente mejora la selectividad y reduce la toxicidad12,13. Sin embargo, aún no se ha establecido una búsqueda sistemática y estratégica de inhibidores alostéricos, especialmente contra proteínas de membrana; la mayoría de las enzimas respiratorias son proteínas de membrana.

Los HCO son enzimas respiratorias terminales presentes en los tres dominios de la vida: bacterias, arqueas y eucariotas. Los HCO reciben electrones de la cadena respiratoria y reducen el oxígeno molecular a agua. Esta reacción exergónica se combina con el bombeo de protones a través de la membrana, lo que contribuye a mantener la fuerza motriz de protones que se utiliza para la producción de ATP14,15,16,17,18. Los HCO son complejos de múltiples subunidades y su constitución varía entre especies; sin embargo, la subunidad I es una subunidad catalítica común en todos los HCO. Contiene un hemo de espín bajo y un centro binuclear (BNC), el sitio catalítico formado por un hemo de espín alto y un ion de cobre. El hemo de espín bajo primero recibe electrones y los transfiere al BNC para la reducción de oxígeno16,17,18,19.

Los eucariotas se originan de la simbiosis entre Alphaproteobacteria y archaea20. Por lo tanto, las subunidades I a III codificadas por el ADN mitocondrial de la citocromo c oxidasa mitocondrial (mtCcO), análogas a los HCO eucarióticos, son descendientes de las enzimas respiratorias de las bacterias20,21 y son residuos funcionalmente importantes y, por lo tanto, su estructura central se conserva, aunque el los residuos restantes no son los mismos. Además, la mtCcO de los mamíferos tiene 10 subunidades más codificadas por el ADN genómico. Las funciones fisiológicas de estas subunidades no están del todo dilucidadas16. Las estructuras centrales de las proteínas fundamentales, como las ARN polimerasas o los ribosomas, también son similares entre especies; Curiosamente, han adquirido subunidades adicionales que modulan su función a lo largo de la evolución molecular22,23. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la superficie de la estructura central de los HCO, que están cubiertos por hélices adicionales en los mamíferos, podría contener sitios alostéricos, regulando su actividad de manera positiva o negativa. La existencia de una hélice adicional en mtCcO de mamíferos hace que las bolsas sean distintas de los HCO bacterianos.

En este trabajo, identificamos un sitio inhibidor alostérico enterrado dentro de mtCcO eucariótico. La conformación estérica alrededor del bolsillo de unión de los HCO está muy conservada entre las bacterias y los eucariotas, aunque estos últimos tienen una hélice extra. La diferencia estructural en el alosterio conservado nos permite identificar racionalmente inhibidores bacterianos específicos de HCO: un compuesto antibiótico contra Neisseria gonorrhoeae resistente a ceftriaxona.

Para probar esta hipótesis, primero, necesitamos identificar un sitio inhibidor alostérico. Comenzamos con inhibidores de mtCcO de mamíferos obtenidos mediante selección aleatoria de compuestos. Hemos encontrado previamente que una proteína endógena interactúa directamente con mtCcO y modula alostéricamente la actividad de mtCcO24,25. Este hallazgo nos llevó a realizar un cribado de compuestos aleatorios que modula la actividad de mtCcO; identificamos inhibidores de mtCcO, químicamente distintos de los inhibidores conocidos, incluidos el monóxido de carbono, el óxido nítrico (NO) o los cianuros. Seleccionamos varios inhibidores alostéricos después de estudiar su cinética enzimática (Fig. 1a-d complementaria). Luego intentamos obtener estructuras cristalinas complejas de mtCcO y nuestros inhibidores. A partir de ahora, nos centramos en T113, ya que su sitio de unión estaba enterrado dentro de una hélice específica de mamífero, COX7C (Fig. 1a, b). Los datos de difracción de rayos X con una resolución de 2,2 Å se obtuvieron de un cristal de mtCcO empapado con T113. También determinamos la estructura apo de mtCcO en las mismas condiciones de preparación (Tabla complementaria 1). La estructura compleja obtenida mostró un sitio de unión del compuesto claro que proporcionó una densidad de electrones adicional en comparación con la proteína, que se encuentra claramente dentro del mtCcO (Fig. 2a complementaria). El mapa diferencial Fo (T113) – Fo (DMSO) confirmó que esta densidad de electrones no se originó a partir de moléculas de agua o lípidos, y mostró la diferencia más alta (Fig. 2b complementaria). El bolsillo de unión era diferente del sitio de unión del oxígeno molecular o del citocromo c, la ruta de la vía de transferencia de electrones, la vía de protones o el canal de acceso al oxígeno16,19, lo que sugiere que T113 es un auténtico inhibidor alostérico.

una estructura de rayos X de mtCcO con T113. El mapa de densidad de electrones (2Fo–Fc), contorneado en 1σ, se muestra a la izquierda. El modelo de cinta de mtCcO con T113 en la esfera se muestra a la derecha. T113 estaba cubierto por COX7C (rojo), oculto a la superficie. b T113 estaba rodeado por 4 hélices transmembrana (TM1–3, COX7C) y enterrado desde la superficie, visto desde el espacio entre membranas. La superficie molecular de la proteína se muestra en gris en la vista de primer plano. Tres hélices de la subunidad I que rodean el sitio alostérico se muestran en azul oscuro, las otras hélices de la subunidad I en azul pálido, la subunidad COX7C en mtCcO se muestra en rojo.

Tres de las cuatro hélices que rodean el sitio alostérico de mtCcO pertenecen a la subunidad I, común en los HCO. Además, notamos que la conformación estérica de las hélices cerca del hemo de bajo espín está bien conservada en los HCO bacterianos (Fig. 2a y Fig. 3 complementaria). Estas observaciones nos llevaron a suponer que podíamos examinar razonablemente los inhibidores alostéricos de los derivados de nuestros inhibidores de mtCcO, que probablemente se dirijan al sitio alostérico correspondiente de las oxidasas bacterianas.

a Sitios alostéricos de mtCcO mitocondrial (izquierda) y E. coli bo3 UqO (centro). Las hélices de la subunidad I se muestran en azul, TM0 de la subunidad I en púrpura, la subunidad COX7C se muestra en rojo y las otras hélices en amarillo. Las vistas combinadas se muestran (derecha) con E. coli bo3 UqO en gris. COX7C está lo suficientemente cerca para cubrir el inhibidor. Todas las hélices de la subunidad I se fusionan entre mtCcO y E. coli bo3 UqO excepto TM0. b Detección de 434 productos químicos a 50 µM frente a E. coli bo3 UqO. Los datos se presentan como un promedio de un duplicado. c Inhibición dependiente de la dosis de N4 específica sobre la actividad enzimática de bo3 UqO. Los datos se presentan como un valor promedio de réplicas técnicas en dos experimentos independientes. d Análisis cinético de bo3 UqO con DMSO y molécula de N4 25 µM. Las líneas de ajuste se calculan utilizando la ecuación de Michaelis-Menten con el modelo de inhibición no competitiva. Los datos se presentan como un valor promedio de réplica técnica. La reproducibilidad fue confirmada por dos experimentos independientes. Los datos de origen están disponibles como un archivo de datos de origen.

Para la preparación de una biblioteca personalizada, aplicamos el cribado de compuestos in silico originados a partir de dos inhibidores de mtCcO, incluidos T113 y T151, que obtuvimos en el cribado inicial de alto rendimiento; También se encontró que T151 se unía al sitio alostérico (Fig. 1d complementaria). Compuestos estructuralmente similares a los que se recopilaron principalmente mediante múltiples algoritmos de búsqueda basados ​​en ligandos de 80 millones de compuestos disponibles comercialmente. Luego, nuestro algoritmo interno los integró, los clasificó y eligió la primera serie de 285 compuestos26,27. Agregamos el segundo conjunto de 149 compuestos elegidos por simulación de acoplamiento, que examinó los mismos 80 millones de compuestos contra el bolsillo alostérico de mtCcO. En total, establecimos una biblioteca personalizada que consta de 434 compuestos que tienen una alta probabilidad de unirse al sitio alostérico conservado para HCO. Probamos esta biblioteca frente a mtCcO y, como resultado, 47 compuestos inhibieron mtCcO en más del 40 % a 50 µM (11,4 %), más que la tasa de aciertos habitual de la detección aleatoria, lo que verificó que nuestra biblioteca personalizada concentró inhibidores de mtCcO (Fig. 4a).

Utilizamos E. coli bo3 ubiquinol oxidasa (bo3 UqO) para probar nuestra hipótesis como un HCO bacteriano modelo. Nuestra biblioteca personalizada se evaluó contra bo3 UqO y obtuvimos 15 compuestos exitosos que mostraron una inhibición >40 % para bo3 UqO a 50 µM (Fig. 2b). Entre ellos, se adquirieron con éxito ocho inhibidores comunes tanto para mtCcO como para bo3 UqO y, lo que es más importante, dos inhibidores específicos para bo3 UqO (Fig. 2c). Como era de esperar, uno de estos inhibidores, N4, se ajustó bien a la curva inhibitoria alostérica evaluada por la ecuación de Michaelis-Menten (Fig. 2d).

Para obtener evidencia directa de que N4 se une al sitio alostérico correspondiente, determinamos la estructura de bo3 UqO unido a N4 con un fragmento Fab a una resolución de 3.0 Å usando microscopía electrónica criogénica (crio-EM) (Fig. 3a, Fig. 5e complementaria). h, y Tabla Suplementaria 2). También determinamos la estructura apo de bo3 UqO a 3.1 Å en las mismas condiciones de preparación (Fig. 5a-d complementaria). Los mapas diferenciales entre las estructuras holo y apo demostraron una densidad adicional explícita, y esta densidad fue la principal diferencia encontrada (Fig. 5i complementaria). En particular, el sitio de unión estaba expuesto a la superficie y adyacente a la hélice transmembrana 1 (TM1), TM2 y TM3 de la subunidad I, lo que corrobora fuertemente nuestra hipótesis (Fig. 3b, c). Había enlaces de hidrógeno entre Asp75, Arg71 y N4. La superficie de potencial electrostático de los sitios de unión mostró que bo3 UqO tiene una superficie más hidrofílica que mtCcO, lo que sugiere que es poco probable que T113 hidrofóbico se una a bo3 UqO (Fig. 3d). Mientras tanto, el N4 relativamente hidrofílico no es un aglutinante factible para el bolsillo alostérico de mtCcO, un entorno más hidrofóbico, lo que explica que N4 sea un derivado de T113, pero son inhibidores mutuamente excluyentes para bo3 UqO o mtCcO, respectivamente. Los mutantes para los residuos de aminoácidos alrededor del inhibidor en la estructura demostraron un cambio significativo en el efecto inhibidor, lo que confirma que N4 se une definitivamente a bo3 UqO en el bolsillo (Fig. 5j complementaria).

un mapa de densidad Cryo-EM (izquierda) y el modelo de cinta (derecha) de bo3 UqO en complejo con N4 (rojo a la izquierda, esfera a la derecha). El sitio alostérico de bo3 UqO está expuesto. b Molécula de N4 en el sitio alostérico de bo3 UqO. El mapa de densidad crio-EM alrededor de N4 se muestra en rojo. Las interacciones moleculares entre Asp75, Arg71 y N4 se muestran como líneas de puntos. c N4 es accesible desde la superficie. La superficie molecular de la proteína en el plano de Fe en el hemo b se muestra en gris. Se presentó la molécula de N4 completa. d La superficie de potencial electrostático del sitio alostérico de bo3 UqO (izquierda) y mtCcO (derecha). e Inhibición del crecimiento por N4 durante 24 h de cultivo de E. coli de tipo salvaje (Wild), cepa bo3 UqO-knockout (Δbo3) y cepa dependiente de bo3 UqO (Δbd). f Un ensayo de viabilidad dependiente del tiempo y la concentración. Una línea punteada indica inoculación (1 × 105 CFU/ml). Los datos se confirman por triplicado biológico (e) o duplicado (f). El color de las hélices es el mismo que en la Fig. 2. Los datos de origen están disponibles como un archivo de datos de origen.

Un inhibidor específico de los HCO bacterianos podría tener potencial como antibiótico. Para probar esta posibilidad, evaluamos la inhibición del crecimiento de E. coli por N4. En E. coli, existen dos ramas para las oxidasas terminales en la cadena respiratoria, bo3 UqO y citocromo bd oxidasa (bd UqO). E. coli utiliza bo3 UqO en condiciones aeróbicas, mientras que utiliza preferentemente bd UqO en condiciones hipóxicas, como adaptación al medio28. En E. coli de tipo salvaje, no hubo efecto de N4 en el crecimiento; sin embargo, disminuyó significativamente el crecimiento de E. coli en la cepa dependiente de bo3 UqO (Fig. 3e). Esta inhibición del crecimiento se canceló en la cepa bo3 UqO knockout, lo que confirma que la inhibición del crecimiento por N4 fue el resultado de la inhibición de HCO, no un efecto no específico. Para distinguir entre los efectos bactericidas y bacteriostáticos del compuesto, realizamos un ensayo de recuento de colonias y descubrimos que el efecto de nuestro inhibidor, N4, sobre E. coli es bacteriostático (Fig. 3f).

A continuación, para ampliar nuestros hallazgos, probamos la NO reductasa dependiente de quinol (bb3 qNOR), un miembro distante de la familia de HCO de la bacteria patógena Neisseria. En el género Neisseria, la aparición y propagación de N. gonorrhoeae resistente a múltiples fármacos es un problema de salud global considerable29. qNOR reduce el NO a óxido nitroso (N2O) y es una enzima fundamental en la desnitrificación, que oxida los compuestos de nitrógeno para producir energía en condiciones anóxicas30. La desnitrificación bacteriana también juega un papel vital en la protección contra el NO exógeno producido por las células inmunitarias del huésped, por lo que está implicada en la patogenicidad de varias especies bacterianas, incluidas N. meningitidis y N. gonorrhoeae31,32. Estos sugieren que qNOR en Neisseria puede ser un objetivo farmacológico. Usamos N. meningitidis qNOR porque las secuencias de aminoácidos de N. meningitidis qNOR y N. gonorrhoeae qNOR son idénticas en un 98 %, especialmente en un 100 % en la región transmembrana y, lo que es más importante, la estructura de N. meningitidis qNOR se ha resuelto33. Confirmamos que la conformación estérica de tres hélices (TM 3–5 en bb3 qNOR) alrededor del hemo de bajo espín también se conserva en bb3 qNOR (Fig. 4a)34. Empleamos el mismo enfoque para bb3 qNOR que para bo3 UqO. Primero, analizamos nuestra biblioteca personalizada frente a bb3 qNOR y obtuvimos 52 compuestos exitosos que mostraron una inhibición >50 % de bb3 qNOR a 50 µM (Fig. 4b). Entre ellos, encontramos un inhibidor específico de bb3 qNOR, Q275. Q275 no se cruzó ni con mtCcO ni con bo3 UqO (Fig. 4c). Q275 no afectó la respiración celular de las células de mamíferos, ni la viabilidad celular de las mismas (Fig. 4d, e). Confirmamos que Q275 tiene un modo de inhibición alostérico (Fig. 4f). Además, los mutantes sustituidos con aminoácidos alrededor del sitio alostérico correspondiente de bb3 qNOR mostraron un cambio considerable en el efecto inhibidor, lo que confirma que Q275 se une a bb3 qNOR en el bolsillo (Fig. 4g).

a La conformación estérica alrededor del hemo de espín bajo se conserva en bb3 qNOR (PDB: 6fwf). Una sombra roja indica el sitio alostérico, distinto del sitio de unión de quinol. b Detección de 434 productos químicos a 50 µM en N. meningitidis bb3 qNOR (eje x) y E. coli bo3 UqO (eje y). Q275 es un inhibidor específico de bb3 qNOR, que se muestra en verde. c Inhibición específica y dependiente de la dosis de Q275 en la actividad de bb3 qNOR. d Q275 no tiene efecto sobre la tasa de consumo de oxígeno en células de mamíferos. N = 6 repeticiones técnicas para cada grupo y reproducidas en dos experimentos independientes. e Q275 no muestra citotoxicidad evaluada en cardiomiocitos de rata. CAROLINA DEL NORTE; DMSO, PC; 1% Tritón X-100. N = 6 repeticiones técnicas para DMSO, 3 para otros grupos. La reproducibilidad fue confirmada por dos experimentos independientes. f Análisis cinético de bb3 qNOR con DMSO y molécula Q275 10 µM. Las líneas de ajuste se calculan utilizando la ecuación de Michaelis-Menten con el modelo de inhibición no competitiva. g El efecto de la sustitución de aminoácidos de bb3 qNOR. Las posiciones de Val293, Val289 y Trp334 se muestran en (a). h Concentración inhibitoria mínima (MIC) de Q275 contra la cepa de referencia de N. gonorrhoeae WHO F y un FC428 resistente a la ceftriaxona. Se añadió nitrito de sodio (20 mM) para imitar una condición de NO. Los datos representan experimentos duplicados. i Recuento de colonias 24 h después del tratamiento con Q275 de N. gonorrhoeae WHO F, FC428 y norB deficientes de ambas cepas. Se añadió nitrito de sodio (20 mM) para imitar una condición de NO. Una línea punteada indica inoculación (5 × 105 CFU/ml). c, f, g Los datos se presentan como un valor promedio de réplicas técnicas en tres (f, g) experimentos independientes. Los datos de origen están disponibles como un archivo de datos de origen.

Finalmente, probamos el efecto antimicrobiano de Q275 contra una cepa clínicamente aislada de N. gonorrhoeae que tiene resistencia a ceftriaxona (FC428); la propagación de la superresistente N. gonorrhoeae se ha convertido en un grave problema de salud mundial4. En particular, Q275 demostró efectos antimicrobianos contra FC428, así como contra la cepa de referencia (WHO F) en condiciones de desafío de NO (ataque de células inmunitarias), imitando el entorno intravital infeccioso (Fig. 4h). Establecimos cepas deficientes en norB, que codifican qNOR, en antecedentes de F de la OMS y FC428. En condiciones de desafío de NO (NaNO2 20 mM), las cepas deficientes en norB tanto en WT como en FC428 no crecieron, lo que respalda aún más que la inhibición del crecimiento está mediada por qNOR. Para distinguir entre los efectos bactericidas y bacteriostáticos con estas cepas deficientes en norB, realizamos un recuento de colonias después de la exposición a NaNO2 y descubrimos que dirigirse a qNOR en N. gonorrhoeae es bacteriostático (Fig. 4i). Estos resultados sugieren que nuestro enfoque desarrolló un inhibidor específico contra un HCO bacteriano patógeno a pedido con un rango estrecho de especificidad, que tiene el potencial terapéutico para abordar la AMR.

A continuación nos centramos en el mecanismo inhibitorio. El sitio de unión de T113 en mtCcO formó un túnel estrecho rodeado por cuatro hélices en total (Fig. 1b). El mapa diferencial Fo(T113)–Fo(DMSO) reveló varias diferencias en la estructura de mtCcO desencadenadas por la unión del inhibidor: el sitio de salida de la vía del protón (Asp50, Asp51), una cadena lateral de Ser382 de TM10 en la subunidad I, y el grupo hidroxifarnesiletilo del hemo a (Fig. 2b complementaria). Estos son los sitios donde se han informado cambios estructurales entre las formas reducida y oxidada de mtCcO, lo que plantea la posibilidad de que T113 haya reducido mtCcO35. Para probar esta posibilidad, analizamos la firma de mtCcO reducida a través de ditionita o por T113. En comparación con un estado completamente reducido inducido por ditionita, mtCcO mezclado con T113 mostró una firma mínima de cambio reductivo en la banda de Soret y un aumento en los espectros de absorción de alrededor de 600 nm, que son características de los hemo reducidos, lo que sugiere que T113 no es un reactivo reductor (Fig. 6 complementaria). Por lo tanto, el cambio estructural que observamos no explica completamente el mecanismo de inhibición.

En el mecanismo de alosteria, una unión efectora transmite la señal al sitio funcional, el sitio ortostérico, mediante una transición de conjuntos conformacionales, que a menudo es difícil de capturar mediante análisis estructural debido a su naturaleza instantánea o posible restricción en la cristalización36. Por lo tanto, para obtener una visión mecanicista, aplicamos simulación de dinámica molecular (MD) de mtCcO con o sin el inhibidor. En general, las simulaciones MD con el inhibidor (holo-MD) no mostraron una deformación estructural significativa. En particular, las trayectorias promedio con el inhibidor mostraron que TM2 de la subunidad I, una de las cuatro hélices que forman el bolsillo de unión del inhibidor, se inclinó en la dirección de TM5/6, aunque TM3 no cambió entre holo y apo-MD (Fig. 5a–c). Este movimiento sugiere que el canal para el oxígeno molecular, la cavidad hidrofóbica rodeada entre TM2/4 y TM5/6, está constreñida. El holo-MD demostró que la distancia entre Glu242 e Ile66, que miran hacia el canal de oxígeno y forman una parte mínima de la sección transversal, se hizo más estrecha en presencia del inhibidor. En contraste, la distancia entre Ile312 y Val287, que enfrentan un camino de salida para el agua producida, no cambió (Fig. 5c, d). Además, realizamos simulaciones adicionales con la eliminación del ligando después de la MD unida al ligando (Re-apo MD). Re-apo MD demostró que TM2 se relajó a la estructura apo inicial, aunque el cambio en el canal de oxígeno no se relajó durante el Re-apo MD, lo que sugiere que el efecto sobre TM2 del inhibidor que está junto a TM2 es más directo que sobre el canal de oxígeno. Estos datos sugirieron que T113 podría interferir con el acceso de oxígeno al BNC, inhibiendo así la reacción enzimática.

a Ejes de TM2 y 3 en una instantánea representativa de una trayectoria de apo-MD, holo-MD y Re-apo MD. Los ejes fueron calculados por herramientas UCSF Chimera y representados por cilindros. Las moléculas de hemo a y T113 se mostraron como barras verdes. b Histogramas de distribución del ángulo para TM2 y 3. c La región enfocada en la simulación MD. Los caminos del canal de oxígeno (rojo) y el canal de agua (verde) fueron calculados por CAVER y se muestran como esferas continuas. TM1-6 en la subunidad I se muestra en azul oscuro y las otras hélices de la subunidad I en azul pálido, la subunidad COX7C en mtCcO se muestra en rojo y las otras hélices en amarillo. d Histogramas de distribución de la distancia entre Glu242-Ile66 en el canal de oxígeno y la distancia entre Ile312-Val287 en el canal de agua. Las flechas muestran el movimiento de TM2 por T113 en (a, c). Las líneas de puntos en b y d muestran el valor de la mediana. e Los espectros Raman de resonancia excitada de 441,6 nm de los hemo mtCcO ((i), (iii)) sin y ((ii), (iv)) con N62. La muestra de mtCcO se irradió con láser dos veces con 10 min de incubación oscura en el medio. Los espectros ((1); azul) y ((2); verde) se obtuvieron de 0 a 3 y 27–30 min en los primeros 30 min de irradiación. Después de 10 min de incubación en la oscuridad, se obtuvieron espectros ((3) negro) y (4) rojo) de 0 a 3 min y de 27 a 30 min en la segunda irradiación de 30 min. La potencia del láser fue de 1 mW para ((i), (iii)) y de 0,1 mW para ((ii), (iv)). f Un experimento de flujo detenido mostró que N62 inhibió la unión de CO a CcO cinco veces más lentamente que el control. Los cambios de absorbancia a 440 nm están asociados con la unión de CO al mtCcO reducido. g Cambios de absorbancia a 430 nm asociados con la unión de CO a la UqO de bo3 de tipo salvaje reducida. Las líneas de ajuste se calculan mediante un modelo de decaimiento de una fase. El rango de datos se presenta como una desviación estándar de cuatro repeticiones para CcO y tres repeticiones para bo3 UqO. Los datos de origen están disponibles como un archivo de datos de origen.

Para probar si T113 tiene un efecto alostérico en el canal de oxígeno, realizamos espectroscopía de resonancia Raman, un método sensible para detectar cambios estructurales que no pueden evaluarse mediante análisis estructural de cristales de rayos X. Como T113 tiene autofluorescencia, seleccionamos sus derivados y elegimos N62 debido a su mayor afinidad sin autofluorescencia (Figura complementaria 4b, c). Confirmamos que N62 se unió al mismo sitio de unión en la cocristalografía (Fig. 4d complementaria) y dio una pequeña diferencia alrededor de 440 nm en la absorción de hemo similar a la de T113 (Fig. 4e complementaria). Usamos N62 para los análisis espectroscópicos Raman de ahora en adelante. Anteriormente, se informó que la luz visible induce la fotorreducción de mtCcO, donde el hemo a se reduce inicialmente, seguido del hemo a337. La Figura 4e representa los espectros de resonancia Raman de mtCcO con y sin N62, centrándose en la fotorreducción de los hemos. La banda de resonancia Raman a 1356/1372 cm−1 es asignable al modo ν4 de los hemos (hemo a y hemo a3), un indicador del estado redox: 1356 cm−1 para el estado reducido, 1372 cm−1 para el estado oxidado38. En condiciones de control sin N62, la irradiación láser a una potencia de láser de 1 mW demostró la fotorreducción de hemos. Cuando se detuvo la irradiación, el oxígeno disponible provocó la restauración de los hemos oxidados, invirtiendo las bandas del marcador redox. La reirradiación con el láser demostró una reducción de los hemos nuevamente (Fig. 5e (i)). Por el contrario, mtCcO con N62 mostró un comportamiento de fotorreducción diferente. Con N62, se observó una reducción comparable de los hemos con una potencia de láser baja de solo 0,1 mW. En particular, la interrupción de la irradiación láser no disminuyó la banda del marcador de reducción y la reirradiación mostró un aumento adicional (Fig. 5e (ii)). Estos datos indican que N62 inhibe la reoxidación de los grupos hemo fotorreducidos por el oxígeno. Para sondear la unión de oxígeno de manera más directa, a continuación analizamos el modo de estiramiento Fe-His (νFe-His) del hemo a3, el sitio de unión de oxígeno, a 215 cm−1, que representa el estado reducido coordinado en 5 del hemo a3. Las bandas de 215 cm−1 desaparecerán cuando el oxígeno molecular se una al hemo a3. mtCcO sin N62 exhibió un ciclo de aumento/disminución de la banda de 215 cm−1 (Fig. 5e (iii)); sin embargo, mtCcO con N62 demostró un aumento continuo en la banda de 215 cm-1 (Fig. 5e (iv)), lo que proporciona una evidencia experimental de que N62 inhibe la unión de oxígeno al hemo a3. La inhibición de la reoxidación del hemo a3 por el oxígeno reduce el umbral de la fotorreducción, lo que indica que el cambio estructural en el cristal mtCcO fue causado presumiblemente por la reducción inducida por rayos X durante la adquisición de datos.

Para reforzar aún más el efecto del inhibidor sobre el canal de oxígeno, realizamos un experimento de flujo detenido en el que pudimos evaluar directamente el acceso del monóxido de carbono (alternativa al oxígeno molecular) al centro binuclear39. Como se muestra en la Fig. 5F, N62 inhibió la unión de CO a CcO cinco veces más lentamente que el control. Por lo tanto, concluimos que la inhibición alostérica en el canal de acceso al oxígeno juega un papel importante en la inhibición de mtCcO.

Es plausible que el alosterio que encontramos en mtCcO también se conserve entre los HCO bacterianos y sus inhibidores. Con este fin, creamos una sustitución de un solo aminoácido en los aminoácidos que se enfrentan al canal de oxígeno de bo3 UqO, que puede manipularse genéticamente. Entre los mutantes realizados, las sustituciones menos voluminosas de Glu286 y Phe112, que corresponden a Glu242 y Phe67 en mtCcO (Figs. 3c y 5c), redujeron el efecto inhibidor de N4 (Fig. 6c complementaria). Además, para obtener evidencia directa, realizamos un experimento de flujo detenido con bo3 UqO. Como N4 tiene una absorbancia de alrededor de 400 a 450 nm, usamos N62 para este experimento. N62 es un derivado de T113 y un inhibidor común tanto para mtCcO como para bo3 UqO. Primero, confirmamos que el efecto inhibidor de N62 en bo3 UqO también fue reducido por los mutantes en el canal de oxígeno al igual que N4 (Fig. 6d complementaria). Un experimento de flujo detenido con bo3 UqO demostró que el inhibidor también desaceleró la unión de CO en bo3 UqO, como lo hizo en mtCcO (Fig. 5g). En conjunto con estos análisis multimodales, concluimos que nuestros inhibidores de HCO obstruyen alostéricamente la entrada de oxígeno molecular/NO al BNC mediante un cambio conformacional de una hélice transmembrana de la subunidad I, lo que inhibe la función de HCO.

Los medicamentos con un modo de acción único son fundamentales para expandir nuestras opciones antimicrobianas para superar la AMR, especialmente en los casos en que los patógenos, incluida la N. gonorrhoeae, han adquirido resistencia a todos los antibióticos actualmente disponibles, se propagan por todo el mundo y se vuelven intratables40. La cadena respiratoria ha sido un objetivo potencial para el desarrollo de antibióticos; los inhibidores alostéricos son más deseables que los ortostáticos para minimizar el riesgo de efectos secundarios, considerando la importancia de la cadena respiratoria en la vida. Aquí, identificamos alostería conservada en HCO y una hélice adicional que solo se encuentra en mtCcO eucariota. Esta diferencia estructural en el alosterio nos permitió aislar los inhibidores específicos para dos HCO bacterianos diferentes, incluido un antibiótico contra N. gonorrhoeae resistente a la ceftriaxona, que es una de las cinco amenazas urgentes en el informe de 2019 de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades3 .

Este estudio es una prueba de concepto, y el compuesto aún se encuentra en la etapa inicial de desarrollo de fármacos; sin embargo, nuestros hallazgos allanarán el camino para el desarrollo de antibióticos con un mecanismo de acción diferente. La comparación de las estructuras publicadas de HCO reveló que la conformación estérica alrededor del hemo de espín bajo está muy conservada en todos los HCO de bacterias, levaduras, plantas y mamíferos (Fig. 3 complementaria) 41, lo que sugiere que el sitio alostérico identificado por es probable que se conserve. Por lo tanto, nuestro enfoque puede generar inhibidores específicos, antibióticos potenciales, para cada HCO bacteriano bajo demanda con un rango estrecho de especificidad. El desarrollo de agentes de espectro reducido está en línea con el requisito actual de minimizar el efecto sobre el microbioma del huésped y prevenir la resistencia generalizada42. Dirigirse a los HCO puede no ser simple, ya que las bacterias patógenas a menudo tienen múltiples oxidasas terminales en su cadena respiratoria. Por lo tanto, un inhibidor de HCO deseable como antibiótico es el que se dirige específicamente a una etapa infecciosa particular en la que los patógenos requieren críticamente el HCO para adaptarse al entorno de crecimiento43, como hemos demostrado qNOR como un objetivo terapéutico para N. gonorrhoeae en este estudio, o Se puede usar con otros antibióticos como terapia combinada. Nuestros resultados sugieren que los efectos del inhibidor de UqO sobre E. coli y el inhibidor de qNOR sobre N. gonorrhoeae fueron bacteriostáticos. Aunque la acción bactericida suena preferible, rara vez se ha documentado la superioridad de la acción bactericida sobre la bacteriostática44. Se necesita más investigación y desarrollo de inhibidores de HCO para llegar al ámbito clínico.

Una de las cuatro hélices en mtCcO que rodean el bolsillo alostérico es la subunidad COX7C codificada por el genoma, que cubre la superficie como si ocultara el sitio alostérico. Nuestro análisis filogenético indicó que el sitio alostérico de los HCO antiguos estaba expuesto, y se ha sellado en HCO mitocondriales eucariotas durante la evolución molecular (Fig. 7 complementaria). La subunidad específica de eucariotas podría proteger a mtCcO del acceso a los inhibidores, o podría haber un inhibidor endógeno que regule negativamente la actividad de mtCcO en un momento específico. El papel evolutivo de la subunidad adquirida requiere más investigación.

Combinados con experimentos de flujo detenido, espectroscopia Raman de resonancia y análisis de mutantes, concluimos que nuestros inhibidores de HCO obstruyen alostéricamente la entrada de oxígeno/NO molecular al BNC mediante un cambio conformacional de una hélice transmembrana de la subunidad I, lo que inhibe la función de HCO. Sin embargo, en particular en el caso de bo3 UqO, el sitio de unión de N4 es el sitio de unión de quinol. La estructura quinona-bo3 UqO confirma que N4 ocupa el espacio donde se une el sustrato45. Asp75 y Arg71 son los mismos aminoácidos N4 utilizados para la interacción molecular que la quinona45, lo que sugiere que N4 inhibe la UqO de bo3 al obstruir la unión del sustrato. Estos hallazgos sugieren que el espacio rodeado por TM0 y TM1–3 de bo3 UqO funciona como un sitio de unión al sustrato y como un sitio de inhibición alostérica que propusimos. TM0 solo está presente en las quinol oxidasas, incluida bo3 UqO. Estabiliza eficazmente el ubiquinol hidrofóbico en la región transmembrana para que bo3 UqO pueda usarse como sustrato; la existencia de TM0 hace que la familia de las ubiquinol oxidasas sea única. TM0 no se encuentra en otros tipos de HCO, en los que el sitio alostérico que propusimos es distinto del sitio de unión al sustrato, como se muestra en qNOR que no tiene TM0.

Con respecto a mtCcO, demostramos que el mecanismo inhibitorio sobre la entrada de oxígeno juega un papel importante en la inhibición de T113 y N62 para mtCcO; sin embargo, otros mecanismos inhibitorios también podrían estar involucrados, como en el caso que discutimos para N4 en bo3 UqO. Encontramos el cambio estructural en Asp50/51 y Ser382 en la estructura cristalina mtCcO-T113. Razonamos que fue causado por la fotorreducción durante la preparación de la muestra y la reducción inducida por radiación por las siguientes razones. (1) el cambio en Asp50/51 y Ser382 se encuentra en la forma reducida de la estructura CcO; sin embargo, la simple adición de T113 no provocó la reducción de CcO (Figura complementaria 6a, b). (2) la irradiación láser durante la adquisición de datos Raman provocó una reducción de CcO. La Figura 5e sugiere que el inhibidor de mtCcO redujo el umbral de fotorreducción. (3) La simulación MD con el inhibidor no causó el cambio estructural en Asp50/51 (Fig. 6e complementaria). Estas observaciones, sin embargo, no eliminaron la posibilidad de que la unión de T113 induzca el cambio estructural encontrado en Asp50/51 y Ser382. El cambio en estos residuos podría afectar el bombeo de protones o la transferencia de electrones; Asp50/51 y Ser382 son residuos esenciales para el bombeo de protones, especialmente en mtCcO, formando el canal H como sugieren Yoshikawa et al.16, aunque el canal H solo se encuentra en mtCcO. Rich y colegas indicaron que el canal H funciona como un pozo dieléctrico17. Además, el grupo Sharma informó recientemente que el cambio conformacional en el dominio portador de Ser382 afecta la transferencia de electrones46. Por lo tanto, la perturbación en la región puede provocar la inhibición del bombeo de protones o la transferencia de electrones. Se justifica un estudio adicional.

Nuestra simulación MD de 100 ns nos dio una pista importante sobre el mecanismo alostérico del inhibidor mtCcO; sin embargo, Re-apo MD no mostró que el canal de oxígeno relaja la apo. Es posible que se necesite una MD más larga para aclarar los detalles del mecanismo molecular.

Nuestro enfoque se puede aplicar para encontrar moduladores alostéricos en otros objetivos terapéuticos. Las enzimas generalmente adquieren dominios o subunidades adicionales a lo largo de la evolución molecular22,23. Como la cadena respiratoria en bioenergética es fundamental y esencial para la vida, las enzimas respiratorias distintas de los HCO también se conservan entre las especies, y también sus estructuras centrales. El tamaño de la molécula de estas enzimas respiratorias es mayor en eucariotas que en sus contrapartes bacterianas. Es probable que contengan alosteria dentro de la proteína en el límite de las estructuras entre eucariotas y bacterias, lo que lleva al desarrollo de antibióticos, ya que la cadena respiratoria es un objetivo comprobado para los antibióticos. Además, cualquier molécula fundamental esencial para la vida y conservada entre especies podría ser un objetivo potencial. Además, los péptidos adicionales podrían contener un sitio alostérico positivo en el borde de su estructura central; un modulador alostérico positivo para la enfermedad humana de pérdida de función podría ser una dirección terapéutica.

Generalmente, la búsqueda de un sitio alostérico es desafiante, requiere un trabajo experimental considerable para cada proteína diana y es difícil de aplicar a otras. El concepto de alosteria conservada enterrada ayudará a desarrollar un enfoque sistemático, que ha sido deseado críticamente. El número de estructuras proteicas ha aumentado considerablemente con la aparición de la crio-EM y los avances recientes en la predicción estructural como Alphafold2 y RoseTTAfold47,48. La comparación de estructuras de proteínas entre especies, no solo estructuras estáticas sino también conjuntos generados por MD, acelerará la búsqueda de sitios alostéricos conservados enterrados. Por lo tanto, en conclusión, este estudio abrirá nuevos caminos en la ciencia de las proteínas y el desarrollo terapéutico, especialmente para antibióticos con diferentes mecanismos de acción.

La solución y los cristales de citocromo c oxidasa de corazón bovino se prepararon como se describe en un estudio anterior49. Antes de la congelación, los cristales se trataron con compuesto 2 mM o DMSO en el medio final.

Los experimentos de rayos X se llevaron a cabo en las líneas de luz SPring-8 BL26B1/B2. El procesamiento y el escalado de los datos de difracción se llevaron a cabo utilizando XDS50. La fase inicial fue calculada por MOLREP51 utilizando un modelo de código PDB 5B1A después de eliminar las moléculas no proteicas. Para mejorar la densidad y eliminar el sesgo del modelo, se realizó el método de máxima entropía en Phenix52. Para el cálculo del mapa de densidad de electrones diferencial entre con y sin compuesto, se utilizó el cálculo del mapa Fo-Fo en CNS53 con un modelo de ligando omitido. La reconstrucción se realizó utilizando COOT54. Los modelos se refinaron con REFMAC555 y phenix.refine56 con los parámetros atómicos revisados ​​por el Dr. Tomitake Tsukihara. Para eliminar el sesgo del modelo, todos los mapas de densidad de electrones utilizados en la reconstrucción se calcularon con el modelo de compuesto omitido. Los mapas de densidad electrónica se confirmaron con muestras repetidas. Las estáticas de refinamiento se proporcionan en la Tabla S1.

El mtCcO purificado y los compuestos se incubaron en placas de 96 pocillos a 30 °C durante 30 min en tampón de ensayo (pH 7,4 fosfato potásico 50 mM, albúmina sérica bovina al 0,1 %, Lyso PG 14:0 al 0,025 %). Para iniciar la reacción enzimática, se añadió a la mezcla citocromo c reducido (1,5 µM), luego se leyeron las placas a 550 nm utilizando un lector de placas. Se calculó la pendiente durante 60 s y se exportó el cambio en la actividad de mtCcO comparándolo con la muestra tratada con DMSO como control negativo.

Las soluciones de mtCcO para espectroscopia se prepararon a mtCcO 15 µM con y sin N62 50 µM en tampón de fosfato de sodio 60 mM y n-decil-β-d-maltósido al 0,2 % (pH 6,8) y sus espectros se midieron a 4 °C a menos que se indique lo contrario . Los espectros de absorción se midieron en una cubeta de paso de 3 mm con un espectrofotómetro (lamda650, PerkinElmer). Los espectros se presentaron con valores de absorbancia equivalentes a 1 cm. El mtCcO oxidado se midió en aire y el mtCcO reducido en ditionito se midió en N2. Los espectros de resonancia Raman se midieron en una celda giratoria a 2000 rpm con la longitud de onda de excitación a 441,6 nm (un láser HeCd, Kimmons). La luz dispersada Raman fue detectada por un espectrómetro Raman (500M, SPEX) conectado con CCD (Symphony II, Horiba) con una geometría de dispersión de 90°. Se preparó una solución de mtCcO oxidada en reposo para mediciones Raman y se transfirió a la celda giratoria sellada con un tabique de goma en una caja de guantes (MM3-H60S, MIWA) a un nivel de oxígeno por debajo de 100 ppm. El tampón usado y el septo de goma se desgasificaron y se incubaron en la caja con guantes durante la noche. La solución de muestra así preparada contenía solo una pequeña cantidad de oxígeno residual, lo que aseguró la observación de una fracción de hemo a3 reducida de cinco coordenadas en la medición de fotorreducción, evitando al mismo tiempo la oxidación total inmediata de todo el hemo a3.

El sistema modelo se construyó a partir de la estructura cristalina mtCcO bovina reducida (código de ID de PDB 3AG2) para realizar simulaciones MD de todos los átomos. Se eliminaron todas las moléculas de agua cristalina presentes en la estructura atómica 3AG2 del código ID de PDB. Los átomos de hidrógeno faltantes de los sistemas se agregaron con el programa tleap en AmberTools 2020 (ref: https://ambermd.org/CiteAmber.php). El campo de fuerza Amber ff14SB para proteínas, agua e iones57, y el campo de fuerza Amber lipid14 para lípidos58 se adoptaron en las simulaciones MD. Todo el mtCcO monomérico de 13 subunidades se sumergió en una bicapa lipídica formada por fosfatidilcolina al 50 % y fosfatidiletanolamina al 50 % usando CHARMM-GUI59. La proteína con bicapas lipídicas luego se solvató con el modelo de agua TIP3P en cajas rectangulares. Las cajas se prepararon con márgenes de 20 Å aparte de cada proteína para evitar efectos artificiales por sus imágenes repetidas periódicamente. Los parámetros de centros metálicos y aminoácidos se obtuvieron de un estudio anterior60. Brevemente, el CuA y el hemo a se oxidaron y el hemo a3 y el CuB se redujeron. Los estados de protonación de los residuos se determinaron por el método del continuo electrostático. Los estados de protonación de los residuos importantes son los siguientes: todas las propionas de los hemos a y a3 fueron desprotonadas, Arg438 y 439 fueron desprotonadas, Asp364 y ​​Glu242 fueron desprotonadas, His290 e His291 fueron protonadas en la posición δ. Para neutralizar cada sistema con contraiones, se seleccionaron al azar algunas moléculas de agua y se reemplazaron con un conjunto de iones Na+ o Cl−. Se empleó el método Ewald de malla de partículas (PME) para las interacciones de Coulomb61. Todas las simulaciones MD se realizaron utilizando el software GROMACS 201962. Todo el sistema membrana-proteína-disolvente constaba de 302 004 átomos para apo-MD y 302 029 átomos para holo-MD. Las simulaciones MD se realizaron bajo un conjunto de NPT constante (300 K y 1 atm) usando un paso de tiempo de 2 fs.

Se consideraron los siguientes tratamientos (a–c) para equilibrar cada sistema: (a) La minimización de energía se realizó en 10 000 pasos. (b) Se realizó una equilibración MD de 100 ps con el termostato V-rescale63 a 300 K por debajo de 1 atm, y (c) se realizó una equilibración MD de 100 ps con el acoplamiento Berendsen64 a 300 K por debajo de 1 atm. Cada instantánea se grabó cada 1 ps65. Finalmente, se realizó una simulación MD de 100 ns bajo un conjunto de NPT constante (300 K y 1 atm) como corridas de producción y los últimos 80 ns se usaron como análisis. Para obtener trayectorias estadísticamente confiables, realizamos tres corridas con diferentes velocidades iniciales para las apo u holoestructuras.

Para el primer grupo, calculamos el coeficiente de Tanimoto entre cuatro inhibidores de mtCcO y cada uno de los 80 millones de compuestos disponibles comercialmente sobre la base de huellas dactilares 2D (claves MACCS, ECFP4, FCFP4 y GpiDAPH3) y métricas de forma 3D (ComboScore) con el software Pipeline Pilot (BIOVIA, Dassault Systèmes), MOE (Chemical Computing Group) y ROCS (OpenEye Scientific Software). Los compuestos que mostraban valores altos del coeficiente de Tanimoto se agruparon mediante la huella dactilar de ECFP4, y luego se seleccionaron los compuestos en el centro de cada grupo para el ensayo enzimático. Para el segundo grupo, la estructura del complejo mtCcO/T113 se preparó adecuadamente mediante un asistente de preparación en Schrödinger suite 2016-1 (Schrödinger, LLC), y luego se realizó una generación de cuadrícula de receptores para el protocolo de acoplamiento. 80 millones de compuestos disponibles comercialmente se sometieron a acoplamiento molecular contra mtCcO utilizando Glide 7.0. Los compuestos seleccionados en función de la puntuación Glide, que comparte el mismo espacio que T113 en el complejo, se agruparon mediante la huella dactilar ECFP4 y luego se seleccionaron los compuestos en el centro de cada grupo para el ensayo enzimático. Finalmente, se seleccionaron y compraron 434 compuestos.

El plásmido que codifica bo3 UqO con un carboxilo-terminal His-tag en la subunidad II fue un obsequio del laboratorio Gennis66. bo3 UqO se purificó según el método descrito anteriormente67. Brevemente, el plásmido se transformó en la cepa C43 (DE3) Δcyo E. coli y las células se cultivaron en un medio M63. bo3 UqO se solubilizó con 1 % de n-dodecil-β-d-maltósido (C12M) y se purificó con resina TALON, resina Super-Q y cromatografía de exclusión por tamaño, y luego se almacenó en un tampón que contenía Tris-HCl 25 mM, 200 NaCl mM y C12M al 0,02 % (pH 7,5) a una concentración de 10 a 15 mg/ml.

La E. coli bo3 UqO purificada se reconstituyó en liposomas (fosfatidilcolina de yema de huevo: lípido polar de E. coli = 3:1). Se inmunizaron ratones hembra BALB/c cinco veces con dosis de 0,1 mg de bo3 UqO reconstituido con 50 µg de lipopolisacárido, a intervalos de 7 días. Se prepararon suspensiones de células individuales a partir de los bazos de los ratones inmunizados, y las células se fusionaron con células de mieloma P3U1, utilizando el método convencional de polietilenglicol (PEG)68. La detección de anticuerpos se realizó mediante tres métodos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de liposomas (L-ELISA), ELISA desnaturalizado (D-ELISA) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)69. Para L-ELISA, la bo3 UqO purificada se reconstituyó en liposomas que contenían biotinilo-PE y se inmovilizó en placas Immobilizer Streptavidin (Nunc). Los anticuerpos de alta afinidad que formaron complejos estables con bo3 UqO purificada fueron seleccionados por SEC en una columna Superdex 200 5/150 (GE Healthcare). Los anticuerpos que reconocieron la conformación nativa de E. coli bo3 UqO se analizaron mediante D-ELISA con E. coli bo3 UqO desnaturalizado con SDS. Se aislaron tres clones seleccionados mediante el método de cultivo de dilución limitante y se establecieron líneas celulares de hibridomas monoclonales que producían anticuerpos anti-bo3 UqO. El fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal anti-bo3 UqO se preparó como se describe69. Las proteínas bo3 UqO purificadas se mezclaron con el fragmento Fab durante 24 h a 4 °C, y los complejos bo3 UqO-Fab se purificaron mediante SEC, seguido de incubación con N4. Probamos tres clones por cryo-EM y seleccionamos uno para determinación estructural.

La UqO purificada y los compuestos se incubaron en placas de 96 pocillos a 25 °C durante 60 min en tampón de ensayo (pH 7,4, fosfato de potasio 50 mM, ácido etilendiamina-N',N',N',N'-tetraacético 1 mM (EDTA ), 0,1 % de albúmina de suero bovino, 0,15 % de C12M). Para iniciar la reacción enzimática, se añadió a la mezcla una reducción de 40 µM de UQ-1, luego se leyeron las placas a 278 nm utilizando un lector de placas. Se calculó la pendiente y se exportó el cambio de actividad enzimática comparándolo con la muestra tratada con DMSO como control negativo.

Se aplicó una muestra de 3 µL a una rejilla Quantifoil de descarga luminiscente (R1.2/R1.3 malla 300, cobre), se secó en 100 % de humedad a 8 °C y se sumergió en etano líquido usando Vitrobot MkIV. El análisis Cryo-EM se realizó inicialmente utilizando un microscopio Talos Arctica a 200 kV con un detector Falcon3 en KEK. La recolección de datos se realizó utilizando un microscopio Glacios con un detector Gatan K2 Summit en el modo de conteo en RIKEN SPring-8. Las películas se adquirieron con un aumento de ×45 000 con una dosis acumulada de 50,0 electrones por Å2 en 40 fotogramas. El tamaño de píxel fue de 0,889 Å. Los datos fueron adquiridos automáticamente por el método de cambio de imagen de haz utilizando el software SerialEM70.

El procesamiento de datos Cryo-EM se realizó utilizando RELION 3.171. Las pilas de películas sin procesar se corrigieron por movimiento utilizando MotionCor272 de la propia implementación de RELION. Los parámetros de CTF se determinaron utilizando el programa CTFFIND473. Los flujos de trabajo de procesamiento de datos para UqO (12 388 pilas de películas de Glacios) y complejo UqO/compuesto (7173 pilas de películas de Glacios) se resumen en la Fig. S3A–H, respectivamente. La resolución final se estimó mediante la correlación de capa de Fourier estándar de oro (FSC) entre los dos medios mapas refinados de forma independiente (FSC = 0,143). Para la construcción de modelos contra el mapa EM, se generó un modelo inicial mediante el modelado de homología con el paquete de programas MOE (MOLSIS Inc.) y se acopló al mapa final utilizando Chimera74. Luego, el modelo se refinó manualmente utilizando el programa COOT54. El refinamiento del espacio real en el programa Phenix se realizó con los parámetros atómicos de los hemo revisados ​​a partir de los predeterminados52. En la Tabla S2 se proporciona un resumen de los parámetros del modelo y las estadísticas del mapa crio-EM.

E. coli se cultivó durante la noche en medio LB y se diluyó hasta una DO600 de 0,0132. Se añadieron 5 µl de células a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se trataron con un compuesto a concentraciones de 128 µg/ml o diluciones en serie dobles en 100 µl de medio LB. Luego, las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h sin agitar y se leyeron a 600 nm utilizando un lector de placas para cuantificar el crecimiento celular. La tinción C43 (DE3) y C43 (DE3) Δcyo fueron proporcionadas por el Dr. Yoshio Nakatani y se usaron como cepa de tipo salvaje y cepa bo3 UqO-knockout, respectivamente. C43 (DE3) ΔcydΔappx fue proporcionado por el Dr. Robert Gennis y se usó para la cepa dependiente de bo3 UqO. Como N4 a 32 µg/ml demostró la inhibición del crecimiento del ensayo anterior, realizamos un ensayo de viabilidad dependiente del tiempo y la concentración a 32, 128 µg/ml de N4. Se hizo un inóculo de alrededor de 1 × 105 CFU/ml y luego se incubó a 37 °C sin agitación. Las colonias supervivientes se contaron a tiempos fijos (12, 24, 48 y 72 h).

Neisseria meningitidis bb3 qNOR fue proporcionada por el laboratorio Shiro. La expresión y la purificación se realizaron como se informó anteriormente con modificación34.

La cepa de referencia de N. gonorrhoeae WHO F75 y un FC42876 resistente a ceftriaxona se utilizaron para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. N. gonorrhoeae se cultivó en medio GW en CO2 al 5 % a 37 °C sin agitación77. Subcontratamos la preparación del medio al Research Institute for the Functional Peptides Co., Ltd. Se utilizó el método MIC de microdilución en caldo para medir cuantitativamente la actividad antibacteriana in vitro de Q275 contra las cepas bacterianas. La concentración más baja de antibiótico que impidió el crecimiento se interpretó como la CIM. Se añadió nitrito de sodio (20 mM) al medio para imitar una condición desafiante de NO (ataque de las células inmunitarias). Para el ensayo de recuento de colonias, preparamos un inóculo de alrededor de 5 × 105 CFU/ml y luego lo incubamos a 37 °C durante 24 h sin agitar. Se contaron las colonias supervivientes.

Los mutantes de Neisseria gonorrhoeae se construyeron como se describió anteriormente78. Brevemente, para construir el mutante deficiente en norB de N. gonorrhoeae, se amplificó un fragmento de ADN de 4,3 kb del ADN cromosómico FA1090 de N. gonorrhoeae que contenía el gen norB con los cebadores norB-1 y norB-2 mediante la ADN polimerasa PrimeSTAR Max ( Takara Bio) y se clonó en el sitio SmaI del vector pMW119 (4,2 kb) (gen Nippon) para construir pHT1729 (8,5 kb). La región de ADN de 6,5 kb de pHT1729 se amplificó con los cebadores norB-3 y norB-4 mediante la ADN polimerasa PrimeSTAR Max y se ligó con un gen de resistencia a la kanamicina (kan) para construir pHT1739. Un fragmento de ADN de 3 kb que contenía el alelo norB, en el que el gen estructural norB se reemplazó con el gen kan, se amplificó con los cebadores norB-1 y norB-2 de pHT1739, y se transformó en cepas de N. gonorrhoeae y clones resistentes a la kanamicina. seleccionado, dando como resultado mutantes deficientes en norB. Los cebadores utilizados son,

norB-1TCGAGCTCGGTACCCGATGTAGAACTCTTTATCCACTTTCGGCAG

norB-2CTCTAGAGGATCCCCAGGCGGGCAGCCGCCGTTTCCAACGGTTTG

norB-3GGGAAAACCCTGGCGGTTTTAGCCTGAAAATGGAAACCG

norB-4CATAGCTGTTTCCTGTTTGAGAGCTCCTTTTAATAAATC

Para preparar la enzima completamente reducida, una solución de enzima (1 µM de mtCcO o 0,5 µM bo3 UqO), mezclada con DMSO o 200 µM N62, se incubó alternativamente bajo presión de vacío y atmósfera de N2, luego se redujo con ditionito. Se preparó una solución de CO incubando alternativamente bajo presión de vacío y una atmósfera de CO al 20 % para mtCcO o CO al 100 % para bo3 UqO. Para investigar la unión de CO a la enzima reducida, se mezcló un volumen igual de la solución de enzima reducida y la solución de CO en un espectrómetro de flujo detenido a 4 °C.

Se utilizó un analizador de flujo extracelular XFe96 (Agilent) para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR). Se sembraron células C2C12 de ratón en una microplaca de cultivo XFe96 (1,0 × 104 células por pocillo) un día antes de la medición. El OCR de cada pocillo se midió en DMEM no tamponado que contenía l-glutamina 2 mM y piruvato de sodio 1 mM en condiciones basales y en respuesta a oligomicina A 1 µM (Oligo A), cianuro de fluorocarbonilo fenilhidrazona (FCCP) 2 µM y cianuro de fluorocarbonilo fenilhidrazona (FCCP) 0,5 µM. rotenona + antimicina A 0,5 µM (Anti/Rote). El OCR para la producción de ATP se calculó como OCR-Oligo A OCR basal utilizando el generador de informes de prueba de estrés Mito.

Se usó un ensayo de LDH en microplaca (Kit de ensayo de LDH de citotoxicidad, Dojindo, CK12) para determinar la citotoxicidad de Q275. Las células de mamífero utilizadas fueron cardiomiocitos neonatales de rata, cultivados en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%. Las células se sembraron en una placa tratada con cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de 24 horas, el medio se aspiró y se reemplazó con medio fresco que contenía compuestos de prueba. Después de 24 h de incubación, se evaluó la actividad de LDH en el sobrenadante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para adquirir la secuencia de aminoácidos de la base de datos, se seleccionó preferentemente la secuencia cuya estructura cristalina fue dilucidada y registrada en el PDB (se mostró el ID de PDB). Para otras secuencias de aminoácidos, se seleccionaron las representativas en el taxón de los tipos de enzima HCO A, B, C y NOR de acuerdo con el informe anterior41. Estos indicados de la siguiente manera: Bos taurus (5B1A_1), Homo sapiens (5Z62_1), Saccharomyces cerevisiae (6T15_11), Pseudomonas stutzeri (3MK7_1), Rhodobacter capsulatus (6XKX_4), Thermus thermophilus (A2: 2YEV_1, ba3: 1EHK_1), Escherichia coli ( 1FFT_1), Bacillus subtilis (bo3: 6KOB_1, aa3: P24010), Mus musculus (BBA31677), Aquifex (A1: O67935, A2: O67937), Rhodothermus marinus (CAC08532), Paracoccus denitrificans (P08305), Yersinia pestis (WP042593520 ), Pseudomonas aeruginosa (MXH36788), Snodgrassella alvi (WP_100091491), bacteria Rickettsiales (MBB19300), Lacrimispora indolis (VDG67555), Halobacterium (WP_010902450), Natronomonas pharaonis (CAA71525), Geobacillus stearothermophilus (3 AYG) y Pseudomonas aeruginosa (3O0R).

La alineación de múltiples secuencias de aminoácidos se realizó con Clustal Omega v1.2.1 después de recortar el extremo N para alinear la longitud total de la alineación79. Se utilizó un parámetro predeterminado y se confirmó visualmente la conservación de las regiones esenciales para la ruta de los protones (canal de protones) en los HCO, como los ligandos metálicos y los residuos de tirosina catalítica. Los árboles de unión de vecinos (NJ) se infirieron con el algoritmo BioNJ80 utilizando PhyML v2016011581 con los siguientes parámetros: 1000 arranques, 100 semillas y corrección para sustituciones múltiples. Se creó y visualizó un árbol de consenso mayoritario en Dendroscope v3.7582.

No se aplicaron estadísticas, excepto el análisis de SD para la Fig. 5f, g. Los experimentos se repitieron al menos dos veces y confirmaron su reproducibilidad.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Los mapas crio-EM se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con el código de acceso EMD-33293 (apo-bo3 UqO) y EMD-33294 (holo-bo3 UqO). Las coordenadas han estado en el Protein Data Bank (PDB) con el código de acceso 7XMA (apo-mtCcO), 7XMB (holo-mtCcO), 7XMC (apo-bo3 UqO), 7XMD (holo-bo3 UqO). Los códigos de acceso publicados anteriormente utilizados en este trabajo son 5B1A y se utilizó para el cálculo de la fase inicial en el experimento de difracción de rayos X. 3AG2 se utilizó para la simulación MD. Para la figura complementaria 7, 5Z62, 5B1A, 6GIQ, 6KOB, 6WTI, 1QLE, 2YEV, 1EHK, 6XKW, 5DJQ, 3AYG, 3O0R. Los datos fuente subyacentes a las Figs. 2B–E, 3E, 4B–I, 5B, D, F, G, S1A–C, S4A–D, S5D, H, J, S6A–D se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los datos fuente se proporcionan en este documento.

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35600-y

Laxminarayan, R. et al. Resistencia a los antibióticos: la necesidad de soluciones globales. Lanceta Infectada. Dis. 13, 1057–1098 (2013).

Artículo Google Académico

Unemo, M. et al. Vigilancia mundial de la resistencia a los antimicrobianos de la OMS para Neisseria gonorrhoeae 2017-18: un estudio observacional retrospectivo. Lancet Microbe 5247, 3–5 (2021).

Google Académico

Centros de Control y Prevención de Enfermedades. Amenazas de resistencia a los antibióticos en los Estados Unidos. Centros Dis. control anterior 1–113 https://doi.org/10.15620/cdc:82532 (2019).

Unemo, M. et al. Programa Mundial de Vigilancia Antimicrobiana Gonocócica de la Organización Mundial de la Salud (OMS GASP): revisión de nuevos datos y evidencia para informar las acciones de colaboración internacional y los esfuerzos de investigación. Sexo. Salud 16, 412 (2019).

Artículo Google Académico

Bald, D., Villellas, C., Lu, P. & Koul, A. Dirigirse al metabolismo energético en Mycobacterium tuberculosis, un nuevo paradigma en el descubrimiento de fármacos antimicobacterianos. MBio 8, e00272—17-11 (2017).

Artículo Google Académico

Cook, GM, Hards, K., Vilchèze, C., Hartman, T. y Berney, M. Energía de la respiración y fosforilación oxidativa en micobacterias. Microbiol. espectro 2, 1–20 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Goodman, CD et al. Los parásitos resistentes al antipalúdico atovacuona no se transmiten por los mosquitos. Ciencia (80-.) 352, 349–353 (2016).

Artículo ADS CAS Google Académico

Hasenoehrl, EJ, Wiggins, TJ & Berney, M. Inhibidores bioenergéticos: eficacia antibiótica y mecanismos de acción en Mycobacterium tuberculosis. Frente. Celúla. Infectar. Microbiol. 10, 1–26 (2021).

Artículo Google Académico

Duvenage, L., Munro, CA & Gourlay, CW El potencial de la inhibición de la respiración como un nuevo enfoque para combatir los patógenos fúngicos humanos. actual Gineta. 65, 1347–1353 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Shiba, T. et al. Estructura de la oxidasa alternativa insensible al cianuro de tripanosoma. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 110, 4580–4585 (2013).

Artículo ADS CAS Google Académico

Luo, M. et al. La bedaquilina inhibe la levadura y la ATP sintasa mitocondrial humana. común Biol. 3, 1–10 (2020).

Artículo Google Académico

Wenthur, CJ, Gentry, PR, Mathews, TP & Lindsley, CW Medicamentos para sitios alostéricos en receptores. año Rev. Pharmacol. Toxicol. 54, 165–184 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Nussinov, R. & Tsai, CJ Allostery en la enfermedad y en el descubrimiento de fármacos. Celda 153, 293–305 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Tsukihara, T. et al. Toda la estructura de la citocromo c oxidasa oxidada de 13 subunidades a 2,8 Å. Ciencia (80-.) 272, 1136–1144 (1996).

Artículo ADS CAS Google Académico

Iwata, S., Ostermeier, C., Ludwig, B., Hartmut, B. y Michel, H. Estructura a una resolución de 2,8 Å de la citocromo c oxidasa de Paracoccus denitrificans. Naturaleza 376, 660–669 (1995).

Artículo ADS CAS Google Académico

Yoshikawa, S. & Shimada, A. Mecanismo de reacción de la citocromo c oxidasa. química Rev. 115, 1936–1989 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Rich, PR Citocromo c oxidasa mitocondrial: catálisis, acoplamiento y controversias. Bioquímica Soc. Trans. 45, 813–829 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Ishigami, I., Hikita, M., Egawa, T., Yeh, SR y Rousseau, DL Translocación de protones en la citocromo c oxidasa: información sobre la cinética de intercambio de protones y la espectroscopia vibratoria. bioquimica Biografía. Acta—Bioenergía. 1847, 98–108 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Wikström, M., Krab, K. & Sharma, V. Activación de oxígeno y conservación de energía por citocromo c oxidasa. química Rev. 118, 2469–2490 (2018).

Artículo Google Académico

Sagan, L. Sobre el origen de las células mitosantes. J. Teor. Biol. 14, 225–IN6 (1967).

Artículo ADS CAS Google Académico

Wallace, DC ¿Por qué todavía tenemos un ADN mitocondrial heredado por vía materna? Percepciones de la medicina evolutiva. año Rev. Bioquímica. 76, 781–821 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Werner, F. & Grohmann, D. Evolución de las polimerasas de ARN de múltiples subunidades en los tres dominios de la vida. Nat. Rev. Microbiol. 9, 85–98 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Petrov, AS et al. Historia del ribosoma y el origen de la traducción. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 112, 15396–15401 (2015).

Artículo ADS CAS Google Académico

Hayashi, T. et al. Higd1a es un regulador positivo de la citocromo c oxidasa. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 112, 1553–1558 (2015).

Artículo ADS CAS Google Académico

Nagao, T. et al. Higd1a mejora la función respiratoria en los modelos de trastorno mitocondrial. FASEB J. 34, 1859–1871 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Okada-Iwabu, M. et al. Un agonista AdipoR de molécula pequeña para la diabetes tipo 2 y la vida corta en la obesidad. Naturaleza 503, 493–499 (2013).

Artículo ADS CAS Google Académico

Sato, T. et al. Aplicación de la máquina de vectores de soporte a la detección virtual basada en formas tridimensionales utilizando una superposición de formas moleculares tridimensionales integrales con inhibidores conocidos. J. Chem. información Modelo. 52, 1015–1026 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Borisov, VB, Gennis, RB, Hemp, J. & Verkhovsky, MI Las reductasas de oxígeno respiratorio del citocromo bd. bioquimica Biografía. Acta—Bioenergía. 1807, 1398–1413 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Unemo, M. & Shafer, WM Resistencia a los antimicrobianos en Neisseria gonorrhoeae en el siglo XXI: pasado, evolución y futuro. clin. Microbiol. Rev. 27, 587–613 (2014).

Artículo Google Académico

Knapp, JS & Clark, VL Crecimiento anaeróbico de Neisseria gonorrhoeae acoplado a reducción de nitrito. Infectar. inmune 46, 176–181 (1984).

Artículo CAS Google Académico

Falsetta, ML et al. El perfil transcripcional identifica el fenotipo metabólico de las biopelículas gonocócicas. Infectar. inmune 77, 3522–3532 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Stevanin, TMTM, Moir, JWBB & Read, RC Los sistemas de desintoxicación de óxido nítrico mejoran la supervivencia de Neisseria meningitidis en macrófagos humanos y en la mucosa nasofaríngea. Infectar. inmune 73, 3322–3329 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Matsumoto, Y. et al. Estructura cristalina de la óxido nítrico reductasa dependiente de quinol de Geobacillus stearothermophilus. Nat. Estructura. mol. Biol. 19, 238–245 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Gonska, N. et al. Caracterización de la óxido nítrico reductasa dependiente de quinol del patógeno Neisseria meningitidis, una enzima electrogénica. ciencia Rep. 8, 1–13 (2018).

Artículo ADS CAS Google Académico

Yano, N. et al. El grupo de agua que contiene Mg2+ de la citocromo c oxidasa de mamíferos recolecta cuatro equivalentes de protones de bombeo en cada ciclo catalítico. J. Biol. química 291, 23882–23894 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Motlagh, HN, Wrabl, JO, Li, J. & Hilser, VJ La naturaleza de conjunto de la alostería. Naturaleza 508, 331–339 (2014).

Artículo ADS CAS Google Académico

Ogura, T., Yoshikawa, S. & Kitagawa, T. Estudio de resonancia Raman sobre la fotorreducción de la citocromo c oxidasa: distinción de los citocromos a y a3 en los estados de oxidación intermedios. Bioquímica 24, 7746–7752 (1985).

Artículo CAS Google Académico

Kitagawa, T. & Orii, Y. Estudios de resonancia Raman de la citocromo oxidasa. J. Bioquímica. 84, 1245–1252 (1978).

Artículo CAS Google Académico

Salomonsson, L., Lee, A., Gennis, RB y Brzezinski, P. Una tapa de un solo aminoácido genera un compartimento hermético al gas dentro de un transportador unido a una membrana. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 101, 11617–11621 (2004).

Artículo ADS CAS Google Académico

Unemo, M. et al. Gonorrea. Nat. Dis. rev. Prisma. 5, 79 (2019).

Sousa, FL et al. La superfamilia de reductasas de oxígeno hemo-cobre: ​​tipos y consideraciones evolutivas. bioquimica Biografía. Acta—Bioenergía. 1817, 629–637 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Bax, R. & Green, S. Antibióticos: el cambiante paradigma regulatorio y de la industria farmacéutica. J. Antimicrobiano. Quimioterapia. 70, 1281–1284 (2014).

Artículo Google Académico

Kakishima, K., Shiratsuchi, A., Taoka, A., Nakanishi, Y. y Fukumori, Y. Participación de la óxido nítrico reductasa en la supervivencia de Pseudomonas aeruginosa en macrófagos activados por LPS. Bioquímica Biografía. Res. común 355, 587–591 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Rhee, KY & Gardiner, DF Relevancia clínica de la actividad bacteriostática versus bactericida en el tratamiento de infecciones bacterianas grampositivas [2]. clin. Infectar. Dis. 39, 755–756 (2004).

Artículo Google Académico

Li, J. et al. Las estructuras crio-EM del citocromo bo 3 de Escherichia coli revelan fosfolípidos unidos y ubiquinona-8 en un sitio de unión de sustrato dinámico. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 118, e2106750118 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Reidelbach, M., Zimmer, C., Meunier, B., Rich, PR y Sharma, V. Transferencia de electrones acoplada a la dinámica conformacional en la respiración celular. Frente. mol. Biosci. 8, 1–12 (2021).

Artículo Google Académico

Tunyasuvunakool, K. et al. Predicción altamente precisa de la estructura proteica del proteoma humano. Naturaleza https://doi.org/10.1038/s41586-021-03828-1 (2021).

Artículo Google Académico

Baek, M. et al. Predicción precisa de estructuras e interacciones de proteínas utilizando una red neuronal de tres pistas. Ciencia (80-.) 8754, eabj8754 (2021).

Google Académico

Shinzawa-Itoh, K. et al. La estructura de resolución de 1,3 Å de la citocromo c oxidasa bovina sugiere un mecanismo de dimerización. BBA Avanzado. 1, 100009 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. Secta. D Biol. cristalogr. 66, 125–132 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Vagin, A. & Teplyakov, A. MOLREP: un programa automatizado para el reemplazo molecular. Aplicación J. cristalogr. 30, 1022–1025 (1997).

Artículo CAS Google Académico

Adams, PD et al. PHENIX: un sistema integral basado en Python para la solución de estructuras macromoleculares. Acta Crystallogr. Secta. D Biol. cristalogr. 66, 213–221 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Brunger, AT Versión 1.2 del sistema de cristalografía y RMN. Nat. Protocolo 2, 2728–2733 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr. Secta. D Biol. cristalogr. 60, 2126–2132 (2004).

Artículo Google Académico

Murshudov, GN et al. REFMAC5 para el refinamiento de estructuras cristalinas macromoleculares. Acta Crystallogr. Secta. D Biol. cristalogr. 67, 355–367 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Afonine, PV et al. Hacia el refinamiento automatizado de la estructura cristalográfica con phenix.refine. Acta Crystallogr. Secta. D Biol. cristalogr. 68, 352–367 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Maier, JA et al. ff14SB: mejora la precisión de los parámetros de la cadena lateral y la columna vertebral de la proteína de ff99SB. J. Chem. Cálculo de la teoría. 11, 3696–3713 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Dickson, CJ et al. Lipid14: el campo de fuerza ámbar de los lípidos. J. Chem. Cálculo de la teoría. 10, 865–879 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Jo, S., Kim, T., Iyer, VG & Im, W. CHARMM-GUI: una interfaz gráfica de usuario basada en web para CHARMM. J. Cómputo. química 29, 1859–1865 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Sato, W. et al. Mecanismo energético de la formación del complejo de transferencia de electrones citocromo c-citocromo c oxidasa en condiciones de recambio revelado por efectos mutacionales y simulación de acoplamiento. J. Biol. química 291, 15320–15331 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Ewald, PP El cálculo de los potenciales de red ópticos y electrostáticos. Ana. física 369, 253-287 (1921).

Artículo MATEMÁTICAS Google Académico

Abraham, MJ et al. Gromacs: simulaciones moleculares de alto rendimiento mediante paralelismo multinivel desde portátiles hasta superordenadores. SoftwareX 1–2, 19–25 (2015).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. Muestreo canónico mediante reescalado de velocidad. J. Chem. física 126, (2007).

Berendsen, HJC, Postma, JPM, van Gunsteren, WF, DiNola, A. & Haak, JR Dinámica molecular con acoplamiento a un baño externo. J. Chem. física 81, 3684–3690 (1984).

Artículo ADS CAS Google Académico

Morita, R., Nakano, K., Shigeta, Y. & Harada, R. Mecanismo molecular para el dominio de unión a actina de α-actinina Ain1 aclarado por simulaciones de dinámica molecular y experimentos de mutagénesis. J. física. química B 124, 8495–8503 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Lai, LY, Samoilova, RI, Gennis, RB & Dikanov, SA Caracterización de los protones intercambiables en la vecindad inmediata del radical semiquinona en el sitio QH del citocromo bo 3 de Escherichia coli. J. Biol. química 281, 16879–16887 (2006).

Artículo Google Académico

Abramson, J. et al. Purificación, cristalización y estudios cristalográficos preliminares de una proteína de membrana integral, citocromo bo 3 ubiquinol oxidasa de Escherichia coli. Acta Crystallogr. Secta. D Biol. cristalogr. 56, 1076–1078 (2000).

Artículo CAS Google Académico

Köhler, G. & Milstein, C. Cultivos continuos de células fusionadas que secretan anticuerpos de especificidad predefinida. Nature 256, 495–497 (1975).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Tanabe, H. et al. Expresión, purificación, cristalización y estudios cristalográficos de rayos X preliminares de los receptores de adiponectina humanos, AdipoR1 y AdipoR2. J. Estructura. Función genoma 16, 11–23 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Mastronarde, DN SerialEM: un programa para la adquisición automatizada de series de inclinación en microscopios Tecnai mediante la predicción de la posición de la muestra. microsc. Microanal. 9, 1182–1183 (2003).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Zivanov, J. et al. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. Elife 7, 1–22 (2018).

Artículo Google Académico

Zheng, SQ et al. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo Google Académico

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Cómputo. química 25, 1605–1612 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Unemo, M. et al. Las nuevas cepas de referencia de Neisseria gonorrhoeae de la OMS de 2016 para la garantía de calidad global de las investigaciones de laboratorio: caracterización fenotípica, genética y del genoma de referencia. J. Antimicrobiano. Quimioterapia. 71, 3096–3108 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Nakayama, SI et al. Nueva cepa de Neisseria gonorrhoeae resistente a ceftriaxona y a múltiples fármacos con un nuevo gen mosaico penA aislado en Japón. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 60, 4339–4341 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Wade, JJ & Graver, MA Un medio líquido completamente definido, claro y sin proteínas que permite el crecimiento denso de Neisseria gonorrhoeae a partir de inóculos muy bajos. FEMS Microbiol. Letón. 273, 35–37 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Takahashi, H. & Watanabe, H. Un homólogo gonocócico del gen meningocócico γ-glutamil transpeptidasa es un nuevo tipo de pseudogén bacteriano transcripcionalmente activo pero fenotípicamente silencioso. BMC Microbiol. 5, 1–13 (2005).

Artículo Google Académico

Sievers, F. & Higgins, DG El paquete de alineación múltiple clustal omega. Métodos Mol. Biol. 2231, 3–16 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Gascuel, O. BIONJ: una versión mejorada del algoritmo NJ basada en un modelo simple de datos de secuencia. mol. Biol. Evol. 14, 685–695 (1997).

Artículo CAS Google Académico

Guindon, S. et al. Nuevos algoritmos y métodos para estimar filogenias de máxima verosimilitud: evaluación del rendimiento de PhyML 3.0. sist. Biol. 59, 307–321 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Huson, DH et al. Dendroscopio: un visor interactivo para grandes árboles filogenéticos. BMC Bioinforme. 8, 1–6 (2007).

Artículo Google Académico

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En primer lugar, todos los autores agradecen enormemente al Dr. Tomitake Tsukihara y al Dr. Shinya Yoshikawa por sus valiosos consejos y discusión sobre el proyecto. Agradecemos enormemente a la Sra. Akiko Ogai por la ayuda en la preparación de proteínas; Sra. Satomi Kobayashi, Sra. Kanami Inagaki, Sra. Keiko Shingu y Sra. Satomi Gion por su asistencia en el laboratorio; Sra. Yuko Okada, Sra. Hisae Kawasaki y Sra. Yukako Kurokawa por la asistencia de secretaria; Dr. Yuki Nakamura por la ayuda en la adquisición de datos en SPring-8 BL26; Dr. Hiroshi Aoyama por la ayuda en la preparación de cristales para el experimento de rayos X; Dr. Takeshi Yokoyama, Dr. Tomomi Uchikubo, Dr. Mikako Shirouzu por la orientación del análisis de partículas individuales crio-EM; al Dr. Naruhiko Adachi y al Dr. Masato Kawasaki por la selección inicial para la adquisición de datos crio-EM de la preparación de E. coli bo3 oxidasa (bajo BINDS 1721); al Dr. Robert Gennis y al Dr. Sangjin Hong por proporcionar cepas de E. coli y construcción de oxidasa bo3 de E. coli; Dr. Yoshio Nakatani por proporcionar cepas de E. coli; Dr. Ken Daniel Inaoka y Dr. Kiyoshi Kita por proporcionar cepas de E. coli y consejos sobre la preparación de proteína bo3; al Dr. Vivek Sharma por su ayuda en la preparación para la simulación MD; al Dr. Hiroshi Sugimoto por su asesoramiento sobre el análisis estructural de bo3; Dr. Naoki Mochizuki, Dr. Kazu Kikuchi y Dr. Hajime Fukui por sus comentarios sobre el manuscrito, Dr. James Pearson por la edición en inglés; Sra. C. Shintani por sus consejos sobre la preparación de figuras. Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de Plataforma para Apoyar el Descubrimiento de Fármacos y la Investigación en Ciencias de la Vida (Bases para Apoyar el Descubrimiento de Fármacos Innovadores y la Investigación en Ciencias de la Vida (BINDS)) de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) bajo los Números de Subvención, JP19am0101113, JP21am0101070, JP20am0101071 , JP21am0101082, JP20am0101109, JP20am0101083 (números de soporte 1096, 1099, 1721, 2161, 2310 y 2357). Los experimentos de radiación de sincrotrón se realizaron en SPring-8 con la aprobación del Instituto de Investigación de Radiación de Sincrotrón de Japón (JASRI) (Propuesta No. 2016A2529, 2016B2711, 2017A2555 y 2017B2721, 2018A2721, 2021B2523, 2022A2713). Este trabajo fue apoyado por fondos de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón-Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST) ​​bajo el número de subvención, JPMJCR14M2 a ST AMED bajo el número de subvención, JP19im0210617, JP21ek0109499 y JP22fk0108632 a YShintani. JP21fk0108605 a MO Grants-in-Aid for Scientific Research from the Japan Society for the Promotion of Science bajo Grant Numbers, 21H02914 to ST, 21K15443 to YN, 19H05784 to MK, and 20K03794 to KK Grants-in-Aid for Innovative research "Biometal Sciences" con el número de subvención 20H05497 a Y.Shigeta.

Hideki Shigematsu

Dirección actual: División de Biología Estructural, Instituto de Investigación de Radiación Sincrotrón de Japón, SPring-8; Sayo, Hyōgo, Japón

Estos autores contribuyeron por igual: Sachiko Yanagisawa, Rikuri Morita.

Departamento de Farmacología Molecular, Centro Nacional Cerebral y Cardiovascular, Suita, Osaka, Japón

Yuya Nishida, Chisa Nakabayashi, Takemasa Nagao, Tasneem Qaqorh, Yusuke Takahashi, Satoru Yamazaki y Yasunori Shintani

Departamento de Bioquímica Médica, Escuela de Graduados de Ciencias Biológicas Fronterizas de la Universidad de Osaka, Suita, Osaka, Japón

Yuya Nishida, Takashi Iwamoto, Chisa Nakabayashi, Hisakazu Kato, Tasneem Qaqorh, Seiji Takashima y Yasunori Shintani

Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Hyogo, Hyogo, Japón

Sachiko Yanagisawa, Kyoko Shinzawa-Itoh, Waka Matsumura, Kazumasa Muramoto, Yoshitsugu Shiro y Minoru Kubo

Centro de Ciencias Computacionales, Universidad de Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, Japón

Rikuri Morita, Ryuhei Harada y Yasuteru Shigeta

RIKEN SPring-8 Center, 1-1-1 Kouto, Sayo, Hyogo, Japón

Hideki Shigematsu, Chai Gopalasingam y Takehiko Tosha

Centro RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas, Yokohama, Kanagawa, Japón

Hitomi yuki y teruki honma

Departamento de Química, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Chiba, Inage, Chiba, Japón

Satoshi Ogasawara y Takeshi Murata

Departamento de Bacteriología I, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Tokio, Japón

Ken Shimuta, Hideyuki Takahashi, Yukihiro Akeda y Makoto Ohnishi

Centro de Investigación de Resistencia Antimicrobiana, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Tokio, Japón

Ken Shimuta

Centro de Aprendizaje Integrado de Educación Básica, Instituto de Tecnología de Kanagawa, Atsugi, Kanagawa, Japón

katsumasa kamiya

División de Análisis de Cristales de Proteínas, Instituto de Investigación de Radiación Sincrotrón de Japón, SPring-8, Sayo, Hyogo, Japón

Nobuhiro Mizuno y Takashi Kumasaka

Departamento de Microbiología y Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina de la Universidad de Toho, Tokio, Japón

Yoshikazu Ishii

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Y.Shintani concibió el proyecto y realizó la detección del inhibidor mtCcO. Y.Shintani y YN diseñaron la estrategia experimental y analizaron los datos. YN realizó cristalografía de rayos X, análisis de partículas individuales crio-EM, detección de compuestos in silico y la mayoría de los experimentos bioquímicos. S.Yanagisawa realizó experimentos espectroscópicos Raman de resonancia y analizó los datos con WM y MKRM, realizó una simulación MD y analizó los datos con KK, RH, HY, YN e Y.Shigeta. HS realizó la adquisición de datos cryo-EM y ayudó al análisis de datos. NM y TK contribuyeron a la recopilación de datos de cristales y ayudaron al análisis estructural de rayos X. KSI proporcionó cristales de mtCcO y mtCcO bovinos purificados durante todo el proyecto. YN realizó un cribado de compuestos in silico con HY bajo la supervisión de THSO y TM generó los anticuerpos monoclonales para el análisis crio-EM de bo3 oxidasa. KS, HT, YA y MO proporcionaron las cepas de N. gonorrhoeae y realizaron la determinación de la CIM. YI analizó y brindó asesoramiento sobre los experimentos con N. gonorrhoeae. TI realizó el experimento bioquímico bo3. CN realizó el experimento bioquímico Neisseria meningitidis bb3 qNOR. HK realizó la medición OCR utilizando XFe96 Fluxanalyser. S. Yamazaki, TN, TQ y YT realizaron análisis de datos, incluido el análisis filogenético y la preparación de figuras. CG, KM, TT e Y.Shiro proporcionaron la enzima bb3 qNOR, la construcción de expresión y el entorno experimental para qNOR. Y.Shintani, YN preparó el manuscrito original. ST ayudó con la revisión del manuscrito original y la financiación adquirida. Todos los autores revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Yasunori Shintani.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Nishida, Y., Yanagisawa, S., Morita, R. et al. Identificación de antibióticos basados ​​en diferencias estructurales en el alosterio conservado de las hemo-cobre oxidasas mitocondriales. Nat Comun 13, 7591 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34771-y

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Recibido: 15 mayo 2022

Aceptado: 07 noviembre 2022

Publicado: 08 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34771-y

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