Crio

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 9930 (2022) Citar este artículo

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La microscopía electrónica criogénica se convirtió en una poderosa herramienta para estudiar objetos biológicos. Para los objetos no biológicos (soluciones, geles, dispersiones, arcillas), la polémica sobre la interpretación de los resultados de la microscopía criogénica continúa dividiéndose en dos tendencias contradictorias: considerar la estructura como un estado casi real de la muestra o como artefactos de congelación. En este estudio, se investigó la microestructura de una gama de soluciones y dispersiones acuosas estables (agar, caolín, montmorillonita, nanopartículas) mediante crio-SEM y LSM confocal para comparar estructuras criofijadas y no congeladas. La correlación notada entre estos dos métodos para los sistemas estudiados (agar, caolín, montmorillonita, NP) permitió afirmar que la microestructura ordenada es una característica inherente de estos sistemas. Se discutieron algunas inconsistencias en las dimensiones de la microestructura y se prescribieron a las diferencias en las capas de interfaz y de volumen. Supuestamente, las soluciones de NaCl también poseen una microestructura dinámica (nivel de femtosegundos) de grupos de agua pura e iones de Na+ y Cl- solvatados que pueden tener un impacto en las propiedades anormales de los electrolitos.

Desde el descubrimiento de la microscopía electrónica criogénica (crio-EM) hace más de treinta años, se han acumulado muchos datos en este campo1,2. Esta técnica de imagen permite observar especímenes en micro y nanoescala en su entorno acuoso nativo, sin el secado que provoca una deformación irreversible de la estructura. La observación se hace posible debido a la solidificación del agua por agentes criogénicos, es decir, la criofijación. Este último es un paso crítico en esta técnica: la congelación ultrarrápida evita el crecimiento de cristales de hielo manteniendo intactas las estructuras originales. La criofijación generalmente se logra sumergiendo una muestra en un agente criogénico (aguanieve de nitrógeno, propano, etano, etc.), seguida de fractura (para observar la estructura interna de la muestra) y sublimación (es decir, grabado con hielo) que permite observar estructura sin capa de agua. Hoy, la técnica crio-EM se convirtió en una poderosa herramienta para estudiar objetos biológicos. Una larga discusión sobre la congruencia entre su microestructura en estados criofijados y no congelados se completó con el consenso de que los resultados crio-EM reflejan un estado casi real de las muestras biológicas en parte de sus elementos estructurales más densos (esqueleto, membrana, etc.). )1,2. El consenso se basó en los datos acumulados que muestran la correlación entre diferentes técnicas de imagen. En cuanto a los componentes biológicos líquidos y gelificados (mocos, líquidos inter y extracelulares, etc.), aún quedan dudas que pueden deberse a las dificultades de visualización de estructuras de baja densidad (bajo contraste, movilidad, etc.) . Una de las formas de resolver este problema es desarrollar técnicas que permitan observar muestras húmedas en condiciones cercanas a las nativas a alta resolución. En esta dirección, se informó sobre el desarrollo de un nuevo SEM atmosférico (ASEM), que es una combinación de un microscopio electrónico de barrido invertido (con una placa de cultivo abierta desmontable) y un microscopio de fluorescencia3. El ASEM permite observar casi simultáneamente la misma área desde la parte superior e inferior de la muestra en solución acuosa (encapsulada en una película de SiN permeable a los electrones) a presión atmosférica. Mediante esta técnica se han obtenido imágenes de conexiones neuronales, osteoblastos, retículo endoplásmico, tejidos óseos, endocitosis celular y mitosis3,4.

En comparación con los objetos biológicos, los sistemas acuosos no biológicos (p. ej., soluciones, dispersiones, geles, arcillas) no poseen límites de fase definidos (densos) en el agua, y la interpretación de sus resultados crio-EM sigue siendo ambigua y se divide en dos tendencias contradictorias. Según una tendencia, la microestructura observada en las muestras criofijadas se interpreta como resultado de la formación de cristalitos acuosos, como un artefacto de congelación5,6,7,8,9,10,11. Este último aparece cuando las sustancias disueltas/dispersas se difunden hacia la periferia del cristal de hielo, lo que lleva a la formación de la estructura7. Dentro de otra tendencia, la microestructura de las muestras criofijadas se considera casi en estado real. Este punto de vista a menudo es respaldado por la correlación con imágenes de microscopía de barrido láser (LSM) óptica o confocal, como se demostró, por ejemplo, para fluidos de fracturación espumados, emulsiones formadas con pectina de manzana, dispersiones de nanopartículas, arcillas minerales8,11,12, 13,14,15. Las diferencias observadas en la dimensión de la microestructura (si se comparan los resultados de LSM y crio-EM) no se interpretaron y, por lo tanto, se confundieron8. Las opiniones contradictorias de la microestructura criofijada indican una inconsistencia de los resultados experimentales con el concepto generalmente aceptado de soluciones y coloides como moléculas/iones/partículas homogéneamente distribuidas en solvente16. Por lo tanto, la polémica sobre la interpretación de las observaciones de microscopía criogénica de muestras no biológicas aún está en curso y se necesita más investigación para aclarar este problema.

Otra cuestión fundamental está relacionada con la vitrificación del agua y/o el tamaño de los cristales de hielo formados durante la criofijación. Se sabe que el agua pura se puede vitrificar como una capa delgada o una pequeña gota a velocidades de congelación rápidas (también llamadas "tasas de enfriamiento críticas (mínimas)"), que es del orden de ~ 106 K/s2,17,18. La presencia de solutos reduce las tasas críticas de enfriamiento en órdenes de magnitud. Para una variedad de solutos (etanol, metanol, cloruro de sodio, glicerol, etilenglicol, dextrosa, etc.), la tasa crítica de enfriamiento es una función exponencial de la concentración y se correlaciona con el radio de Stokes del soluto17. Sin embargo, en la práctica de crio-EM, las tasas de enfriamiento logradas aún están muy por debajo de los límites teóricos18. Se cree que la fracción de volumen de hielo cristalino es lo suficientemente pequeña dentro de la muestra y no impide las reconstrucciones de alta resolución2,18. Es decir, para las muestras sin límites de interfase distinguidos en el agua, quedan dudas: ¿qué observamos realmente en las mediciones crio-EM: estructura de la muestra o artefactos de congelación? ¿Observamos que existía una microestructura de solvato dinámico en estado líquido que "detuvimos" en el momento de la criofijación, o la microestructura se creó en el momento de la congelación? El problema se complica aún más por las similitudes obvias entre las estructuras criofijadas de soluciones y dispersiones de diferente naturaleza química de solutos (minerales arcillosos, polisacáridos, geles coloidales, etc.): se han observado comúnmente microestructuras de panal, esponjosas y laminares10,11,14 ,15. Estas similitudes en la microestructura generalmente se interpretaron como una prueba de la existencia de artefactos congelados que no representan la realidad8,9.

En este estudio, el objetivo fue investigar una microestructura de soluciones y dispersiones acuosas estables de sustancias de diferente origen químico (agar, caolín, montmorillonita, óxido de hierro ultrapequeño y nanopartículas de plata (MAg NP)), mediante microscopía electrónica de barrido criogénica. (crio-SEM) y LSM confocal, y para comparar microestructuras criofijadas y no congeladas. En ambos métodos, las muestras se investigaron como una gota con un volumen similar (no como una capa delgada, cuya estructura puede diferir significativamente de la microestructura a granel y depende de las interacciones de interfase19). Además, se realizó un estudio crio-SEM de soluciones de NaCl (0,2–20% en peso) y se observó una microestructura dependiente de la concentración altamente ordenada. Se supuso una estructuración dinámica de iones Na+ y Cl− solvatados y clusters de agua pura en estado líquido.

En nuestro estudio, las muestras se mantuvieron voluminosas durante las mediciones crio-SEM y LSM confocal. Esto es importante porque la microestructura de la capa delgada difiere significativamente de la de las materias a granel y depende en gran medida de la interacción del límite de fase19. En cryo-SEM, se colocó o vertió una muestra en un orificio en el trozo de la muestra (Fig. 1a). La preparación de muestras para las mediciones de LSM se realizó utilizando una junta de goma para proporcionar volumen (aumentar el grosor de las capas) (Fig. 2a). Los colorantes fluorescentes (fluoresceína, rodamina B, Atto 550 NHS) introducidos en las muestras permitieron utilizar una potencia de láser ultrabaja (0,01–0,15 mW) que minimiza el calentamiento de la muestra, la distorsión y la evaporación del agua durante las mediciones.

Fotos de un trozo de gel de agar con rodamina B y lanzadera de muestra con soporte de aluminio de 10 mm con el gel preparado para mediciones crio-SEM (a); Imágenes crio-SEM de gel de agar con rodamina B (b).

Fotos de un trozo de gel de agar con rodamina B y portaobjetos de vidrio con el gel preparado para mediciones de LSM confocal (a); imágenes LSM confocales de gel de agar con rodamina B (longitud de onda de excitación 561 nm, potencia del láser ~ 0,14 mW): "islas" (b), globulares (c imágenes izquierda y central) y estructuras en capas (c derecha); microestructuras ordenadas (d). Se ajustaron el contraste y el brillo.

Se observaron dos tipos de microestructuras, esponjosa y lamelar, que coinciden como "islas" mezcladas caóticamente con formas irregulares (20–400 µm de tamaño) y bordes irregulares, durante las mediciones crio-SEM del gel de agar con rodamina B (Fig. 1b) . La microestructura esponjosa es más fina, con una escala de ~ 1 µm, mientras que la laminar es más grande, con una escala de ~ 10 µm. Las "islas" están separadas de la microestructura de laminillas de mayor escala por una capa delgada que difiere de la microestructura a granel de la "isla" (Fig. 1b, segunda fila). Las laminillas están estrictamente orientadas a distancias de hasta 100 µm, mientras que los elementos laminares individuales son discontinuos (Fig. 1b, fila inferior). Las mediciones de Cryo-SEM mostraron la presencia de una microestructura ordenada en gel de agar con rodamina B.

Las imágenes LSM confocales del gel de agar con rodamina B también revelaron "islas" con formas irregulares (Fig. 2b). De manera similar a los resultados de cryo-SEM, las "islas" son estructuras volumétricas con formas irregulares de 20 a 400 µm de tamaño. En la mayoría de los casos, las "islas" y el espacio entre "islas" parecían uniformes y el orden de la microestructura no es visible. Sin embargo, se encontraron varios ejemplos distintos de ordenamiento de microestructuras, principalmente cerca del límite del portaobjetos de vidrio, cuando la "isla" se encuentra sobre el vidrio o estaba "rota" (Fig. 2c-d). En particular, se encontró que algunas de las "islas" consistían en glóbulos (~ 20 µm de diámetro) apilados en filas; el ancho de la fila era de ~ 40 µm (Fig. 2c, izquierda, centro). Dichos glóbulos no se observaron durante el estudio crio-SEM. Además, se notó una estructura en capas en el límite de la "isla"; la distancia entre capas era del orden de 8 a 12 µm (Fig. 2c, derecha). Las estructuras alargadas altamente ordenadas (con una periodicidad de ~ 5 µm) y porosas (escala de ~ 10 µm) presentadas en la Fig. 2d se correlacionan con laminillas y estructuras esponjosas observadas en las mediciones crio-SEM (ver Fig. 1b, fila inferior). Por lo tanto, las mediciones de LSM confocal de la muestra, sin ningún paso de apertura de estructura (eliminación de agua, fractura, sublimación), proporcionan la evidencia de la existencia de microestructura en gel de agar descongelado.

En nuestros estudios anteriores, se demostró que las NP de MAg sintetizadas con extractos naturales (Z. officinale, A. muscaria, S. crispa) forman hidrocoloides estables con una microestructura distintiva14,20,21. Los compuestos de extractos naturales (polisacáridos, proteoglicanos, etc.) forman una capa superficial sobre estas NP proporcionando una alta estabilidad de sus hidrocoloides. La microestructura altamente ordenada de los hidrocoloides de las NP revela principalmente rayas paralelas (laminillas) y estructuras similares a esponjas. La introducción de rodamina B (por el bien de las imágenes de LSM), así como cada cambio en la composición del hidrocoloide, puede influir potencialmente en la microestructura del hidrocoloide. Es por eso que se realizaron imágenes crio-SEM y LSM para el hidrocoloide MAg NP con rodamina B. Por lo tanto, las mediciones crio-SEM revelaron que los MAg NP con rodamina B contienen diferentes tipos de microestructura, como laminillas y esponjas, con diferentes escalas ( ~ 1 µm y ~ 10 µm, entre elementos individuales) (Fig. S2). Las mediciones de Cryo-SEM EDS confirmaron que los elementos de la microestructura están formados por las NP: los elementos Fe y Ag están en los elementos de la microestructura, y el O (del agua) está entre ellos (Fig. S2, a). Las imágenes de gran aumento del elemento de microestructura demuestran que consiste en glóbulos de 100 nm de tamaño (que son nanopartículas con capa de solvatación) (Fig. S2, b). Además, se observó una multiplicidad de formas redondeadas más grandes, de 30 a 100 µm de tamaño (Fig. 3, marcada con líneas de puntos amarillas). Estas estructuras redondeadas consisten en láminas de escala de 10 µm o estructuras esponjosas en el interior y caparazón de escala fina (≤ 1 µm) en el exterior (Fig. 3, imágenes inferiores).

Fotografías de una gota de hidrocoloide MAg NP con rodamina B y lanzadera de muestras con soporte de aluminio de 10 mm con la muestra preparada para mediciones crio-SEM (a), imágenes crio-SEM de hidrocoloide MAg NP con rodamina B: las estructuras redondeadas están rodeadas por puntos líneas (b).

Las mediciones confocales de LSM del hidrocoloide MAg NP con rodamina B revelaron la coexistencia de dos estructuras: irregulares de menor escala (~ 5–10 µm) y formas redondeadas más grandes (20–100 µm). La Figura 4c presenta imágenes LSM confocales de este hidrocoloide a una longitud de onda de excitación de 514 nm y en el modo de reflexión. El modo de reflexión mostró un contorno de borde claro de la estructura redondeada, la simulación 2.5 D (x, y, intensidad) confirmó una reflexión intensa en los bordes de las estructuras observadas. Las formas redondeadas más grandes observadas son similares en tamaño y forma a las observadas durante el estudio crio-SEM. La uniformidad de estas estructuras redondeadas puede estar relacionada con la existencia de una capa de estructura diminuta que se notó en las mediciones crio-SEM (Fig. 4, imágenes inferiores).

Fotografías de una gota de hidrocoloide MAg NP con rodamina B y portaobjetos de vidrio con junta de goma con la muestra entre ellos preparada para imágenes LSM confocales (a); imágenes LSM confocales (longitud de onda de excitación 514 nm, potencia láser 0,01 mW) (b); mediciones de doble canal (excitación 514 nm y modo de reflexión), simulación de 2,5 dimensiones (2,5D) (ejes x, y, intensidad) (c).

En el siguiente conjunto de experimentos, se utilizó arcilla de caolín con fluoresceína para obtener imágenes crio-SEM y LSM confocal. El polvo de caolín (Al2(OH)4Si2O5) es hidrófilo, insoluble en agua y puede formar hidrocoloide estable: arcilla de caolín. Para proporcionar una mejor señal de fluorescencia, se prepararon dos tipos de arcillas de caolín, con rodamina B y fluoresceína. El tinte de rodamina B no mejoró la formación de imágenes (no se muestra) que puede estar relacionado con una adsorción deficiente de rodamina B en partículas de caolín (este tinte es muy soluble en agua y existe principalmente en la fase acuosa de la arcilla de caolín (el sobrenadante está coloreado)). La fluoresceína tiene una mejor afinidad por las partículas de caolín (sobrenadante incoloro) y proporciona un mejor contraste durante la obtención de imágenes LSM confocal que puede estar relacionado con su escasa solubilidad en agua (soluble en NaOH 1 M, 50 mg/ml) y una mejor adsorción en las partículas de caolín. Las mediciones crio-SEM de arcilla de caolín con fluoresceína revelaron microestructuras de laminillas y esponjas (Fig. 5). Las paredes de estas estructuras consisten en microplacas planas: partículas de caolín (encerradas en un círculo con líneas punteadas amarillas en la Fig. 5b).

Fotografías de una gota de arcilla de caolín con fluoresceína y una lanzadera de muestras con arcilla de caolín en un soporte de aluminio preparado para congelación por inmersión con aguanieve de nitrógeno (a), imágenes crio-SEM de arcilla de caolín con fluoresceína (b). Fotos de arcilla de caolín con fluoresceína, portaobjetos de vidrio con junta de goma con arcilla de caolín entre ellos para imágenes LSM confocales (c); Imágenes LSM confocales obtenidas a una longitud de onda de excitación de 405 nm, potencia de láser de 0,002 mW (luz: caolín, oscuridad: agua). Los ejemplos de alineación paralela de microplacas de caolín se describen en líneas discontinuas amarillas (d).

Las mediciones de LSM confocal revelaron una distribución bastante caótica de microplacas de caolín con un rasgo característico: alineación paralela de microplacas de caolín (Fig. 5d, contraste de luz: caolín, oscuridad: agua). Algunos ejemplos de alineación paralela de microplacas de caolín están encerrados en un círculo con una línea de puntos en la Fig. 5d. La última observación se correlaciona con las mediciones crio-SEM.

En la continuación del estudio, se utilizó otra arcilla mineral, la montmorillonita, para imágenes crio-SEM y LSM confocal (Fig. 6a, c). El polvo de montmorillonita ((Na,Ca)0.33(Al,Mg)2(Si4O10)(OH)2·nH2O) es hidrófilo, insoluble en agua y puede formar hidrocoloide estable: arcilla de montmorillonita. Para mejorar las imágenes LSM confocales, se prepararon dos muestras de arcilla de montmorillonita con tintes fluorescentes, fluoresceína y éster Atto 550 NHS. Las mediciones de Cryo-SEM revelaron una microestructura esponjosa porosa de arcilla de montmorillonita (Fig. 6b). La escala de esta microestructura difería en 3 a 4 veces (la Fig. 6b, primera fila, muestra microestructuras de escala de ~ 4 µm y ~ 11 µm). Las mediciones de LSM confocal (Fig. 6d) también revelaron una estructura perforada altamente porosa que se correlaciona con los resultados publicados previamente2,8,9. Aquí, el tamaño de los poros era predominantemente pequeño, ~ 1 µm, con inclusiones individuales de poros más grandes (5–20 µm).

Fotografías de una arcilla de montmorillonita con fluoresceína, lanzadera de muestras con la muestra para crio-SEM (a), imágenes crio-SEM de arcilla de montmorillonita con fluoresceína (b). Fotos de una arcilla de montmorillonita con fluoresceína, una gota entre los portaobjetos de vidrio con junta de goma para imágenes LSM confocales (c); Imágenes LSM confocales obtenidas con una excitación de 405 nm, potencia del láser de 0,002 mW (luz: montmorillonita, oscuridad: agua) (d).

Además, se introdujo el éster de colorante fluorescente Atto 550 NHS (MFCD05865403) en la arcilla de montmorillonita. Este tinte de fluorescencia es soluble en DMSO y tiene afinidad con las partículas de montmorillonita (sobrenadante incoloro). La observación visual de la arcilla de montmorillonita con el éster Atto 550 NHS reveló que la adición de este tinte disminuyó la viscosidad y aumentó la fluidez. Este último se relacionó con la disminución de la tensión superficial de la arcilla de montmorillonita debido a la adición de DMSO, cuya tensión superficial es significativamente menor que la del agua (71,9 y 42,3 mN.m−1 (a 303,2 K) para agua y DMSO, respectivamente)22. Debido a la mayor fluidez (movimiento rápido de partículas), las mediciones de LSM confocal se realizaron sin junta de goma, cubriendo la arcilla con una cubierta de vidrio que reduce el espesor de la muestra (~ 300 µm). Las mediciones de LSM confocal (longitud de onda de excitación de 561 nm, potencia de láser ultrabaja ~ 0,01 mW) revelaron estructuras largas y rectas: líneas (laminillas) (Fig. 7a). Las líneas estaban agrupadas y muy paralelas. También formaron ángulos agudos (~ 38°). Relacionamos la observación de las estructuras de laminillas con la interacción mejorada (afinidad) entre la arcilla mineral y la superficie del portaobjetos de vidrio (debido a la disminución de la tensión superficial y la humectabilidad mejorada de la arcilla). Curiosamente, se observaron estructuras de ángulo agudo similares en la superficie de arcilla de montmorillonita, en el límite muestra/aire, durante las mediciones crio-SEM (Fig. 7b). Estos resultados mostraron que la arcilla de montmorillonita puede revelar diferentes tipos de microestructura, a saber, estructura perforada porosa uniforme y líneas largas muy paralelas (es decir, laminillas), dependiendo del tinte fluorescente agregado y, probablemente, del espesor de la capa. Estos resultados muestran que la microestructura de la arcilla de montmorillonita observada durante las mediciones de LSM confocal depende en gran medida de la interacción de la interfaz en el límite de arcilla/vidrio. Para concluir, los resultados de las mediciones crio-SEM y LSM confocal de arcilla de montmorillonita con fluoresceína se correlacionan entre sí, lo que muestra la existencia de una microestructura bien organizada.

Imágenes LSM confocales de arcilla de montmorillonita con éster Atto 550 NHS (longitud de onda de excitación 561 nm, potencia del láser 0,012 mW, luz—montmorillonita, oscuridad—agua) (a); imágenes crio-SEM de la superficie (límite aire/arcilla) de la arcilla de montmorillonita, las imágenes inferiores muestran similitudes (ángulos agudos marcados con líneas punteadas) entre estructuras observadas mediante técnicas crio-SEM (izquierda) y LSM confocal (derecha) (b) en límites de arcilla montmorillonita/aire y arcilla montmorillonita/vidrio.

En la continuación del estudio, se investigaron soluciones de agua ultrapura y NaCl (0,2-20 % en peso) mediante la técnica crio-SEM. El agua ultrapura reveló una superficie punteada homogénea (Fig. S3, primera fila), mientras que la solución de NaCl (0,2% en peso) reveló estructuras laminares discontinuas con paredes delgadas; la distancia entre laminillas fue de 10 ± 2 µm. A una concentración de NaCl de 0,8 y 0,9% en peso, las paredes de las láminas se volvieron más gruesas y continuas. Las estructuras de láminas formaron dominios que están orientados en diferentes ángulos entre sí. Cuando las concentraciones de NaCl estaban en el intervalo de 1,1 a 1,5% en peso, aparecían los puentes entre las laminillas que transformaban la estructura laminar en similar a una célula. En este caso, el grosor de la pared aumentó y todavía se observó una pluralidad de agujeros en las paredes. A concentraciones de NaCl de 2,0 y 5,0% en peso, la microestructura se volvió completamente similar a una célula. Los elementos similares a células son alargados, su dimensión transversal es de aproximadamente 10 ± 2 µm. A concentraciones de NaCl de 10,0 y 20,0 % en peso, el tamaño de los elementos similares a células disminuyó (dimensión transversal de 5 a 8 µm) y el grosor de la pared aumentó aún más. Las dimensiones longitudinales y transversales de las células elementales se acercaron entre sí (Fig. S3). Se notó una característica como microagujeros en las paredes para soluciones de NaCl en un rango de concentración de 0.8 a 2.0% en peso (Fig. S4). La presencia de microagujeros (de 0,5 a 2,0 µm de diámetro) puede prescribirse a las burbujas de aire o considerarse como una característica específica que proporciona continuidad a las paredes de la microestructura.

El mapeo elemental Cryo-SEM indicó que los elementos Na y Cl se colocaron predominantemente en las paredes de la microestructura, mientras que O (de H2O)—entre las paredes (Fig. 8a). Los elementos Na y Cl se encuentran predominantemente en las paredes de la microestructura (la distribución homogénea del elemento Pt utilizado para la pulverización catódica de plasma indicó que los elementos microestructurales no sobrepasaron la superficie de la muestra afectando el flujo de electrones). La investigación detallada (a nivel de nanoescala) de la estructura de estas paredes mostró que consisten en estructuras redondeadas de < 50 nm de tamaño (Fig. 8b) (las mediciones de cryo-SEM EDS "en el punto" para las esferas observadas no se realizaron debido a la técnica Limitación: a un aumento tan alto (× 100 000), la energía del haz de electrones se derrite y destruye el área de análisis durante el tiempo (~ 30 s) necesario para recopilar el espectro EDS). Para las soluciones de NaCl en el rango de concentración de 0,2 a 5,0% en peso, las estructuras redondeadas se empaquetan aleatoriamente formando paredes de solvatación, mientras que en concentraciones de 10,0 o 20,0% en peso forman alambres alargados (~ 100 nm de espesor, ≤ 3 µm de longitud), que, a su vez, se organizan en un patrón complejo que forma las paredes de una microestructura similar a una célula. Las imágenes crio-SEM de soluciones de NaCl a nivel de microescala demuestran una microestructura volumétrica compleja que, con una mayor concentración, se transforma de lamelar discontinua (al 0,2-1,5% en peso) a una estructura similar a una célula (al 2,0-20,0% en peso) (Fig. S5, S6). La microestructura tridimensional (3D) de las soluciones de NaCl se puede describir como una cantidad de dominios orientados de manera diferente de elementos similares a células agregados. El tamaño de los dominios es de aproximadamente 100–500 µm en cada dimensión. El espesor de las paredes de solvatación aumentó con la concentración de NaCl. La investigación detallada de esta función se presenta en la figura complementaria S7, tabla S1-S3.

Mapeo elemental Cryo-SEM EDS de una solución de NaCl al 10 % en peso: distribución elemental de Na, Cl, O y Pt. El Pt se usó para la pulverización catódica de plasma; su distribución homogénea indica que los elementos microestructurales de la muestra no sobrepasaron la superficie, lo que influyó en el flujo de electrones (a). Imágenes crio-SEM de soluciones de NaCl (0,8–20% en peso): microestructura a nivel de nanoescala (b).

Otra característica interesante notada fue la desviación de las concentraciones atómicas de Na y Cl de la relación estequiométrica: prevaleció la cantidad de átomos de Na o Cl dependiendo del área analizada. En algunas áreas analizadas, la relación entre los átomos de Na y Cl fue de 1: 1,88. Se observó una desproporción entre las distribuciones de átomos de Na y Cl en áreas en el rango de 475–1230 µm2 (aprox. 43,1 ∙ 10−6 mm3, penetración de rayos X ~ 3,5 µm). Tal falta de homogeneidad puede causar un predominio local de ciertas reacciones que resultaron en la formación de compuestos ácidos o básicos como HClO, NaOH, etc. Esta conclusión se correlaciona con estudios previos en los que se confirmó la falta de homogeneidad del pH a microescala de soluciones congeladas de NaCl23,24. En particular, la existencia de un gradiente de pH ∆pH = 0,2 dentro de las paredes de solvatación en la solución de NaCl 20 mM congelada se detectó mediante microscopía de fluorescencia radiométrica23. Otro estudio mostró que los procesos de congelación y descongelación en presencia de NaCl podrían cambiar significativamente el valor del pH y causar la descomposición del ácido gálico24.

Se puede suponer que la microestructura altamente ordenada observada de las soluciones de NaCl refleja un estado casi real, es decir, la microestructura dinámica de los grupos de agua pura y los iones de Na+ y Cl− solvatados densamente empaquetados es una característica inherente de este sistema. Esta suposición puede ser útil para comprender, por ejemplo, anomalías electrolíticas.

Generalmente se acepta que el agua es un líquido altamente estructurado debido a una extensa red de enlaces de hidrógeno; sin embargo, no existe acuerdo sobre cómo debe definirse la estructura25,26. En los últimos años, se encontró que las moléculas de agua pueden formar diferentes tipos de estructuras, por ejemplo, dímeros, tetrámeros, hexámeros y nanoclusters27. Estas estructuras de agua se han visualizado en superficies 2D (en películas de NaCl(001) soportadas por una bicapa de Au(111), NaCl(100) en superficies de Ag(111), Cu(110), etc.)27,28,29 ,30,31. En particular, se encontró que el agua se agrega en varios grupos con los dímeros de agua dominantes en una superficie de Cd(0001)27. Curiosamente, los nanocopos de hielo amorfo se construyeron exclusivamente a partir de dímeros de agua. Se demostró que la ultraalta estabilidad de los dímeros de agua resulta de la mejora inducida por adsorción del momento dipolar del agua27. En las soluciones salinas coexisten dos tipos de moléculas de agua: las que no interactúan y las que interactúan directamente con los iones que forman una capa de hidratación dinámica (capas de solvato)25,26. Se demostró que la estructura del agua en las capas de solvato es diferente de la del agua que no interactúa y revela propiedades diferentes (p. ej., tiene una densidad media mayor que el agua pura)26,32. Los iones hidratados pueden considerarse esferas rígidas en una escala de tiempo de picosegundos, por lo que la solución puede imaginarse como agua líquida a granel con esferas suspendidas33. Aquí, el cambio en las propiedades macroscópicas de las soluciones (p. ej., aumento de la viscosidad) generalmente se relacionó con la alteración de la estructura de enlaces de hidrógeno del agua pura34,35. Sin embargo, las mediciones del tiempo de correlación orientacional de las moléculas de agua en soluciones altamente concentradas de Mg(ClO4)2, NaClO4 y Na2SO4 por medio de espectroscopía de bomba-sonda de femtosegundos revelaron que la adición de iones no tuvo influencia en la dinámica rotacional de las moléculas de agua fuera las primeras capas de solvatación de los iones33. Los resultados obtenidos para agua pura y soluciones altamente concentradas de NaClO4, Na2SO4 mostraron que la descomposición de la anisotropía de los grupos OH unidos al agua no se vio afectada por la presencia de altas concentraciones de iones ClO4-, SO42- y/o Na+. Esto indicó que, incluso en soluciones salinas de alta concentración, los iones con capas de solvatación coexisten con agua pura a granel, lo que se correlaciona con nuestros hallazgos. Además, la formación de agrupaciones ordenadas de partículas se ha visualizado a lo largo de la dirección del flujo en las dispersiones, y se ha interpretado como el origen del espesamiento por cizallamiento en las dispersiones coloidales36.

En este estudio, se investigó la microestructura de los sistemas acuosos estables utilizando técnicas crio-SEM y LSM confocal. Los resultados mostraron la concurrencia de características estructurales observadas por crio-SEM y mediciones de LSM confocal para gel de agar, arcillas minerales (montmorillonita y caolín) e hidrocoloide NP. En particular, para el gel de agar tales características de microestructura comunes eran estructuras volumétricas con formas irregulares de 20 a 400 µm de tamaño, estructuras en capas, estructuras alargadas y porosas altamente ordenadas. Para MAg NP, una característica común fueron las formas redondeadas de 20 a 100 µm de tamaño. Para la arcilla de caolín, un rasgo característico fue la alineación paralela de las microplacas de caolín, mientras que para la arcilla de montmorillonita fue una microestructura esponjosa porosa. Además de las características similares observadas entre los resultados de las dos técnicas utilizadas, también hubo diferencias, como la inconsistencia de la vista general y la dimensión de la microestructura. Este último puede prescribirse a las diferentes zonas de observación de la muestra durante las mediciones: en crio-SEM, se observa la estructura a granel (debido a la fractura de la muestra), mientras que en el estudio LSM confocal, se investigó una capa delgada (unos pocos micrómetros) cerca de la superficie del vidrio ( por ejemplo, a 1 AU de profundidad es ~ 1 µm) (esquema en la Fig. 9a). Como se sabe, la microestructura a granel difiere significativamente de la capa superficial. La Figura 9b presenta los ejemplos de la transición de escala de la microestructura que se produjo en el gel de polisacárido (límite aire/gel), desde el volumen hasta la superficie a través de la capa intermedia. La transición de escala puede ir de una microestructura de escala gruesa en el volumen a una escala fina en la superficie y, viceversa, de una escala fina en el volumen a una escala gruesa en la superficie (Fig. 9b)37. Estas observaciones indican que los resultados de las mediciones LSM confocales de sistemas no biológicos que contienen agua (es decir, sin límites pronunciados en el agua) dependen en gran medida de la interacción vidrio/muestra (afinidad entre ellos, humectabilidad, etc.). Esta conclusión también está respaldada por nuestros resultados de mediciones de LSM confocal de arcilla de montmorillonita con Atto 550 NHS descritas anteriormente. La arcilla de montmorillonita con este tinte de fluorescencia reveló estructuras altamente paralelas que se prescribieron para mejorar la afinidad entre la arcilla y la superficie del vidrio (a modo de comparación, la arcilla de montmorillonita con fluoresceína reveló solo estructuras esponjosas porosas). Por lo tanto, la microestructura de la capa cercana a la superficie (sustrato/muestra, aire/muestra) difiere significativamente en escala y patrón de la del grueso.

Esquema de observación de muestras en mediciones confocales de LSM y crio-SEM (a); ejemplos de transferencia de escala de microestructura a través de capas de transición (encerradas en un círculo con una línea de puntos), desde la superficie hasta el volumen, en el gel de polisacárido en el límite aire/gel37 (b); esquema de microestructura de disolución dinámica (c).

La correlación entre las mediciones crio-SEM y LSM confocal de sistemas estables contenidos en agua (agar, caolín, montmorillonita, MAg NP) permitió concluir que la microestructura ordenada es una característica inherente de estos sistemas. Se supone que las soluciones de NaCl también pueden poseer una microestructura ordenada dinámica (nivel de femtosegundos) que consiste en grupos de agua pura e iones de Na + y Cl- solvatados densamente empaquetados (esquema propuesto en la Fig. 9c). La suposición sobre la existencia de microestructuras puede ayudar a comprender las propiedades anormales (p. ej., densidad, viscosidad, pH) de algunos sistemas acuosos (electrolitos, dispersiones, etc.).

Los reactivos de grado analítico de agar (CAS 9002-18-0, A1296), caolín (CAS 1332-58-7), montmorillonita (CAS 1318-93-0), rodamina B (CAS 81-88-9), fluoresceína ( ácido libre) (CAS 2321-07-5), CaCl2∙2H2O (CAS 10035-04-8), colorante fluorescente Atto 550 NHS éster (MFCD05865403), dimetilsulfóxido (DMSO) (CAS 67-68-5) se adquirieron de Sigma-Aldrich y usado tal como se recibió. Cloruro de sodio con una pureza del 99,9 % (CAS 7647-14-5), hidróxido de amonio (CAS 1310-73-2) de POCH SA Se utilizó agua ultrapura (resistividad > 17 MΩcm) de un sistema de agua GZY-P10 durante todos los experimentos. Para las mediciones crio-SEM, se utilizó agua filtrada estéril ultrapura desionizada (CAS 7732-8-5, Sigma-Aldrich). Se utilizaron portaobjetos de vidrio de 24 × 50 mm (Menzel Gläser) y 18 × 18 mm (Zeiss) y juntas de goma (junta tórica, 13 × 1 mm) para las mediciones de LSM confocal.

En este estudio se utilizó hidrocoloide de NPs ultrapequeñas de óxido de hierro y plata (MAg) cuya preparación, caracterización fisicoquímica y biológica ha sido proporcionada21. Los hidrocoloides MAg NPs son capaces de formar dispersiones acuosas estables y, a alta concentración (≥ 37 mg/ml), geles coloidales. En este estudio, se añadió colorante fluorescente rodamina B al hidrocoloide MAg (concentración de hidrocoloide: NPs-38,2 mg/ml, rodamina B-49,2 µg/ml) para mejorar el contraste en las imágenes de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) (para aplique una potencia de láser ultrabaja que minimice el calentamiento de la muestra y la evaporación del agua durante las mediciones). La concentración de rodamina B en hidrocoloide MAg fue de 49,2 µg/ml. Después de la adición de rodamina B, el hidrocoloide MAg se agitó y almacenó en la oscuridad a 4 °C hasta su uso.

Para preparar gel de agar (5% en peso) con rodamina B, se mezcló una solución de rodamina B (100 µl, 2,95 mg/ml) con 4900 µl de agua y se combinó con polvo de agar (250 mg). La concentración de rodamina B en gel de agar fue de 59 µg/ml. Para disolver el agar, un vaso termoresistente con la mezcla preparada se introdujo en el horno de microondas durante unos minutos evitando que hierva. El gel rígido y transparente enfriado se almacenó en un lugar oscuro a 4 °C hasta su uso.

Para preparar arcilla de caolín (27,5% en peso), se mezclaron 1,5 g de polvo de caolín con 5000 µl de agua, luego se añadieron 1,6 mg de fluoresceína, 150 µl de NaOH 5 M, 300 µl de CaCl2 ∙2H2O (5% en peso), mezclado, sonicado durante 2 h y dejado en la oscuridad a temperatura ambiente durante 48 h. La concentración de fluoresceína en arcilla de caolín fue de 293,5 µg/ml. La arcilla de caolín preparada se almacenó en la oscuridad a 4 °C hasta su uso.

Para preparar arcilla de montmorillonita (30% en peso), se mezclaron 1,5 g de polvo de montmorillonita con 4550 µl de agua, luego se agregaron 1,6 mg de fluoresceína, 150 µl de NaOH 5 M, 300 µl de CaCl2 ∙2H2O al 5% en peso, se mezcló, sonicado durante 2 h y dejado en la oscuridad a temperatura ambiente durante 48 h. La concentración de fluoresceína en la arcilla de montmorillonita fue de 320 µg/ml. La arcilla de montmorillonita preparada se almacenó en la oscuridad a 4 °C hasta su uso.

Para preparar arcilla de montmorillonita con colorante fluorescente Atto 550 NHS éster, se diluyó 1 µl de solución madre de colorante (1 mg/100 µl de DMSO) en 1 ml de agua. Luego, 200 µl de esta solución se mezclaron con 300 µl de agua, 150 mg de polvo de montmorillonita, 10 µl de CaCl2 al 5% en peso · 2H2O, 10 µl de NaOH 5 M. La concentración de éster Atto 550 NHS en arcilla de montmorillonita fue de 3,85 µg/ml. La arcilla de montmorillonita preparada se almacenó en la oscuridad a 4 °C durante 48 h antes de las mediciones.

Las soluciones de cloruro de sodio (0,2–20 % en peso) se prepararon con agua ultrapura.

Las mediciones de crio-SEM se realizaron con el microscopio electrónico de barrido JEOL 7001F equipado con el sistema criogénico PP3000T fabricado por Quorum Technologies (que incluye etapa fría SEM, anticontaminante, cámara de preparación montada en columna, mesa de preparación de muestras PrepDek, pila de bombeo turbo y sistema de enfriamiento de gas frío CHE3000 ). El sistema criogénico PP3000T utiliza el método de congelación por inmersión con aguanieve de nitrógeno para congelar rápidamente las muestras. El nitrógeno líquido se congela a 63 K (−210 °C) en un amplio rango de valores de presión. Sumergiendo un objeto en nitrógeno granizado se obtiene un enfriamiento más rápido que sumergiendo en nitrógeno líquido en su punto de ebullición (‒196 °C). La alta velocidad de enfriamiento evita el crecimiento de cristales de hielo fijándolos en la etapa de nucleación (tamaño de nm severo).2 Siguiendo el protocolo (Manual de usuario de PP3000T v.1.4), se realizó una congelación rápida de muestras en la estación de trabajo (marca registrada PrepDek), que incluye recipientes de aguanieve para preparación y manipulación de muestras y la electrónica de control. Las muestras líquidas se pusieron como una gota (~ 30 µl), gel de agar como una paz en un orificio del trozo de muestra para que sobresalga por encima de la superficie y se montaron en la lanzadera. Después de la congelación, la muestra se transfirió a la cámara de preparación montada en columna utilizando un dispositivo de transferencia criogénica que permite almacenarla al vacío manteniéndola limpia y libre de humedad. La cámara de preparación equipada con grandes superficies frías proporciona las instalaciones para fracturar, sublimar y pulverizar el recubrimiento con plasma de la muestra. En la cámara de preparación, la temperatura de la etapa fría se mantuvo alrededor de ‒185 °C (en la fractura y pulverización de la muestra) con una estabilidad de 1 °C, y el vacío de la cámara estuvo en el rango de 8,5 · 10–4 Pa. Sublimación (grabado en hielo ) se realizó a ‒90 °C; la duración varió según el espécimen y se eligió experimentalmente (típicamente entre 5 y 50 min) a menos que se especifique. El recubrimiento por pulverización catódica de plasma se realizó utilizando un objetivo de Pt. Desde la cámara de preparación, la muestra se transfirió posteriormente a la cámara SEM para su observación. Dentro del microscopio electrónico hay una etapa fría que mantiene las muestras congeladas durante la observación. La temperatura de la etapa fría en el microscopio electrónico se mantuvo a ‒190 ± 2 °C (nivel de vacío ~ 2,6·10–5 Pa). Se adquirieron imágenes de electrones secundarios de la muestra congelada a 5 keV. El análisis de dispersión de energía (EDS) se realizó por medio de un detector de deriva de silicio SDD de área grande X-Max de 80 mm2 (Oxford Instruments) a 15 keV. La medición crio-SEM de las soluciones de NaCl se realizó utilizando un trozo de muestra pulverizado con oro, la duración de la sublimación fue de 30 a 60 min a ‒ 90 °C; el tiempo de sublimación para el análisis cryo-SEM EDS se redujo a 10-15 min (para mantener plana la superficie de la muestra).

La obtención de imágenes de gel de agar, arcillas minerales e hidrocoloide de NP a temperatura ambiente (sin congelación) se realizó utilizando LSM Zeiss LSM 780 confocal equipado con un láser infrarrojo sintonizable de femtosegundos para excitación de dos fotones. La muestra (30 µl o una pieza de gel de 4 × 4 mm) se colocó en un portaobjetos de vidrio (24 × 50 mm), con una junta de goma (junta tórica de 13 × 1 mm) en la parte superior, dentro de la junta de goma (para mantener volumétrica del espécimen durante la medición (espesor de una almohadilla de goma ≈ espesor del espécimen) y cubierto por otro portaobjetos de vidrio (18 × 18 mm) (para reducir la evaporación del agua durante las mediciones) (ver Fig. 2a). Las mediciones de todas las muestras se realizaron utilizando el objetivo C-Apochromat 40x/1,20 W Corr M27 (apertura numérica 1,2) a baja potencia del láser (< 1 % de la potencia nominal del láser; para reducir la evaporación del agua y los cambios inducidos por el láser en la muestra) , ganancia 830. Se aplicó el modo de promedio de línea para la grabación de imágenes. La concentración de rodamina B, fluoresceína y colorantes fluorescentes Atto 550 NHS en las muestras se mencionaron anteriormente, en el apartado "Preparación de soluciones y dispersiones". El gel de agar con rodamina B se midió a una longitud de onda de excitación láser de 561 nm y un rango de emisión de 585 a 735 nm. El hidrocoloide MAg NP con rodamina B se midió a una longitud de onda de excitación de 514 nm, una emisión de 536 a 674 nm y un modo de reflexión. Las imágenes de 2,5 dimensiones (2,5D) (ejes x, y, intensidad) se obtuvieron utilizando una técnica de procesamiento que permite fusionar dos imágenes. Las mediciones de arcillas de caolín y montmorillonita con fluoresceína se realizaron a una excitación de 405 nm y la emisión se registró en el rango de 416 a 493 nm. Se dejó caer arcilla de montmorillonita con éster Atto 550 NHS entre un portaobjetos de vidrio y un cubreobjetos (sin junta de goma) y se midió a una longitud de onda de excitación de 561 nm, con una emisión de 571–670 nm. Todas las imágenes se registraron cerca de la superficie del portaobjetos de vidrio.

Todos los datos generados y analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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El apoyo financiero fue proporcionado por el Centro NanoBioMedical, Universidad Adam Mickiewicz, Poznań, Polonia. El financiamiento de los costos de acceso abierto de la publicación fue proporcionado por el Programa ID-UB de la Universidad Adam Mickiewicz, Poznań, Polonia. El autor está muy agradecido a la Dra. Barbara Peplińska por su colaboración y enseñanza de microscopía electrónica de barrido criogénico, debates fructíferos, comentarios, revisión y edición de artículos. El autor también quisiera agradecer al Dr. Bartosz Grzeszkowiak y al Dr. Weronika Andrzejewska por el tinte fluorescente Atto y el agua ultrapura que amablemente nos regalaron.

Centro NanoBioMedical, Universidad Adam Mickiewicz, 61-614, Poznań, Polonia

Olena Ivashchenko

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OI escribió el texto principal del manuscrito, preparó figuras, realizó mediciones.

Correspondencia a Olena Ivashchenko.

El autor declara que no hay conflictos de intereses.

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Ivashchenko, O. Estudios crio-SEM y LSM confocal de gel de agar, hidrocoloide de nanopartículas, arcillas minerales y soluciones salinas. Informe científico 12, 9930 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14230-w

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Recibido: 18 de marzo de 2022

Aceptado: 02 junio 2022

Publicado: 15 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14230-w

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