Establecimiento de un material particulado artificial

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5955 (2023) Citar este artículo

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El material particulado (PM), un factor de riesgo ambiental, está relacionado con riesgos para la salud, como las enfermedades respiratorias. Este estudio tuvo como objetivo establecer un modelo animal de lesión pulmonar inducida por PM con PM artificial (APM) e identificar el potencial de APM para la investigación toxicológica. El APM se generó a partir de grafito a 600 °C y se combinó con etileno. Analizamos las composiciones de partículas de escape diésel (DEP) y APM y comparamos la toxicidad y el perfil transcriptómico en los pulmones según la exposición. Para el estudio en animales, se administró vehículo, DEP o APM por vía intratraqueal a ratones macho C57BL/6. DEP o APM aumentaron el peso relativo de los pulmones, el número de células inflamatorias y los niveles de proteínas inflamatorias en comparación con el control del vehículo. Las evaluaciones histológicas mostraron un aumento en los macrófagos alveolares del pigmento de partículas y una ligera inflamación en los pulmones de los ratones DEP y APM. En el único grupo APM, se observó inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar e hiperplasia mucosa en los pulmones de algunos individuos. Este es el primer estudio que compara la toxicidad pulmonar entre DEP y APM en un modelo animal. Nuestros resultados sugieren que el modelo animal tratado con APM puede contribuir a comprender los efectos nocivos de la PM en estudios toxicológicos que muestran que la APM puede inducir diversas enfermedades pulmonares según las diferentes dosis de APM.

En 2013, el material particulado (PM) fue clasificado como carcinógeno del grupo 1 por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer de la Organización Mundial de la Salud1. PM es una mezcla compleja de sustancias orgánicas e inorgánicas sólidas y/o líquidas suspendidas en el aire, que incluye carbono orgánico (OC), carbono elemental (EC), hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), iones orgánicos solubles en agua (cloruro, nitrato , sulfato, sodio, potasio y amonio) y metales en la atmósfera natural2. Las fracciones de MP difieren en sus propiedades físicas y biológicas según la estación, la región y las fuentes3,4,5,6,7. Se producen altas concentraciones de OC, EC y PAH durante las estaciones cálidas en áreas de mucho tráfico y durante la noche8,9. En cuanto a los efectos sobre la salud, la exposición a PM, incluidos OC, EC y HAP en el aire ambiente, induce y exacerba los síntomas clínicos de enfermedades pulmonares, hepáticas, renales y cardíacas8,10,11,12,13,14,15. La mayor parte de la investigación se ha centrado en estudios epidemiológicos, mostrando una relación entre los contaminantes del aire y las visitas a la sala de emergencias y los ingresos hospitalarios. Actualmente, se necesitan investigaciones toxicológicas, como estudios in vivo e in vitro, para probar posibles efectos tóxicos en humanos y especular sobre los mecanismos relacionados. Muchos investigadores han utilizado el material de referencia estándar 2975 (SRM2975, partículas de escape diésel, DEP) como componente de PM para estudiar los riesgos para la salud asociados con la exposición a PM. Las carretillas elevadoras industriales emiten DEP e incluyen PAH, nitro-PAH, derivados de PAH oxigenados, compuestos heterocíclicos, aldehídos e hidrocarburos alifáticos16,17. Sin embargo, existen algunas limitaciones en los estudios toxicológicos sobre la exposición a PM. Se requieren grandes cantidades de DEP para probar la toxicidad pulmonar, como la toxicidad por inhalación por exposición a PM, especialmente en concentraciones altas.

Esto genera altos costos para los estudios sobre los efectos a largo plazo de la exposición a PM. Además, entre varias fuentes, los estudios toxicológicos por PM se pueden realizar centrándose solo en la toxicidad de DEP.

En este estudio, sintetizamos PM artificial (APM) en un entorno de laboratorio para usar en lugar de partículas de escape diésel (DEP) para estudios toxicológicos. Analizamos la relación OC/EC y los PAH entre DEP y APM, comparamos las características patológicas del sistema respiratorio y realizamos un análisis transcriptómico de los pulmones después de la exposición a APM y DEP a través de la vía intratraqueal en un estudio in vivo para evaluar el potencial de APM. para su uso en estudios toxicológicos respiratorios.

Nuestro estudio anterior caracterizó los tamaños de partículas y las morfologías de DEP y APM. DEP y APM son generalmente menores de 600 nm y 30 nm, respectivamente18,19. DEP es esférico y está compuesto de aglomerados irregulares, y APM exhibió morfologías típicas de partículas de hollín diesel18,19. En el presente estudio, medimos la relación OC/EC y los PAH para identificar y comparar las composiciones de DEP y APM. Los cocientes OC/EC de DEP y APM fueron 1,52 y 1,23, respectivamente (fig. 1A). Las concentraciones de los siete PAH se midieron utilizando DEP y APM. Las concentraciones de fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzo[a]pireno, indeno [1,2,3-cd] pireno y benzo [g,h,i] perileno fueron 6,42, 1,27, 12,01, 1,56, 0,14, 0,20 , y 0,14 μg/mL en DEP y 137,49, 8,00, 22,76, 9,56, 0,17, 0,50 y 0 μg/mL en APM, respectivamente. Las concentraciones de fenantreno, antraceno, fluoranteno y pireno fueron aproximadamente de 1,89 a 21,43 veces mayores en APM que en DEP.

Composiciones en DEP y APM. (A) relación OC/EC y (B) concentración de PAH en DEP y APM. Los datos representan la media ± SD (n = 3). Carbono orgánico OC, carbono elemental EC, hidrocarburos aromáticos policíclicos PAH, partículas de escape diésel DEP, partículas artificiales APM.

No hay cambios en el peso corporal en el grupo VC. En los grupos DEP y APM, se observaron pesos corporales reducidos. Especialmente, en los grupos APM, hay una reducción significativa de los pesos corporales (Fig. 2A). El peso pulmonar relativo aumentó estadísticamente de forma dependiente de la dosis en los grupos DEP y APM en comparación con el grupo VC (Fig. 2B). El peso pulmonar relativo fue mayor en el grupo APM que en el grupo DEP. Sin embargo, no hubo diferencias en los pesos relativos del timo y el bazo en los grupos DEP y APM en comparación con los ratones VC (Fig. 2C, D).

Cambios en (A) el cuerpo y (B-D) los pesos relativos de los órganos, (E) la población celular, (F-J) las células inflamatorias absolutas y (K-O) la producción de varias citoquinas inflamatorias en el BALF del vehículo, ratones instilados con DEP y APM. Los pesos de los órganos se calcularon mediante la siguiente fórmula: peso relativo de los órganos = peso de los órganos (g)/peso corporal terminal (g) × 100%. Los datos representan la media ± SD (n = 4 o 5 por grupo). #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 o ####p < 0,0001 frente a VC. Partículas de escape diésel DEP, partículas artificiales APM, líquido de lavado broncoalveolar BALF, desviación estándar SD.

Determinamos si DEP y APM causaron inflamación pulmonar y comparamos la proporción y el número de células inflamatorias en BALF después de la exposición a DEP y APM. Primero, medimos la proporción de células inflamatorias en el BALF de ratones. Los macrófagos se observaron principalmente en el grupo de control, lo que representa el 97,75% del total de células. Sin embargo, se observó comúnmente una disminución en la proporción de macrófagos y un aumento en la de neutrófilos en los grupos DEP y APM. Además, las proporciones de eosinófilos y linfocitos aumentaron ligeramente tras la exposición a DEP y APM. En particular, la proporción de eosinófilos fue mayor en el grupo APM que en el grupo DEP en todas las dosis (Fig. 2E). Estos resultados indicaron que DEP y APM indujeron cambios celulares y respuestas inflamatorias en los pulmones.

En segundo lugar, se calculó el número absoluto de células inflamatorias dividiendo la proporción de células inflamatorias por el número total de células. En relación con el grupo de control, el número de células totales y células inflamatorias como macrófagos y neutrófilos, eosinófilos y linfocitos en BALF aumentó en los grupos instilados con DEP o APM (Fig. 2F-J). A excepción de los eosinófilos, el número total de células, macrófagos, neutrófilos y linfocitos en el BALF del grupo DEP aumentó gradualmente de manera relacionada con la dosis. Aunque no se observó dependencia de la dosis para el aumento en el número de células totales y varias células inflamatorias en el BALF del grupo APM, estas fueron más altas en el grupo APM que en el grupo DEP en todas las dosis. En particular, el número de eosinófilos aumentó significativamente solo en el grupo APM. Estos resultados indicaron que aunque la proporción y el número de células inflamatorias en BALF infiltradas por la exposición a DEP y APM diferían ligeramente, tanto DEP como APM iniciaron y mantuvieron respuestas inflamatorias al infiltrar células inflamatorias mixtas en los pulmones de ratones.

Evaluamos los niveles de varias citoquinas inflamatorias en el BALF de ratones instilados con DEP o APM. DEP y APM indujeron un aumento en los niveles de varias citocinas inflamatorias, como interleucina (IL)-5, IL-6, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1) y motivo CXC receptor de quimiocinas 1 (CXCL1)/KC en BALF en relación con el VC (Fig. 2K-O). Aunque no hubo una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de citocinas inflamatorias, incluidas las de IL-5, IL-6, TNF-α y MCP-1, se observó una tendencia creciente en el grupo DEP en comparación con el grupo de control. DEP mejoró significativamente solo los niveles de CXCL1/KC en el BALF. En el grupo APM, los niveles de citoquinas inflamatorias aumentaron significativamente. De acuerdo con los resultados de un aumento en la proporción celular tras la exposición a DEP y APM, la liberación de citoquinas inflamatorias fue más fuerte en el BALF del grupo APM que en el grupo DEP.

Se realizó una evaluación histológica mediante tinción con H&E, MT y PAS para identificar y comparar las características histopatológicas en los tejidos pulmonares de ratones a los que se instiló DEP y APM. Las secciones de pulmón teñidas con H&E revelaron que la instilación de DEP y APM comúnmente resultó en la acumulación de macrófagos alveolares cargados de partículas (flechas negras) de una manera dependiente de la dosis junto con una ligera inflamación pulmonar (flechas rojas; Fig. 3). En los pulmones de algunos individuos de ratones instilados con APM, se observaron inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar e hiperplasia de células mucosas (Fig. 4) mediante tinción con H&E, MT y PAS, respectivamente. Estos hallazgos se confirmaron mediante la puntuación histológica de las secciones de pulmón (Tabla 1). Estos resultados indicaron que la inflamación pulmonar aguda mediada por macrófagos alveolares inducida por DEP y APM y la exposición a APM podrían conducir a una enfermedad pulmonar más grave en comparación con la exposición a DEP.

Cambios histológicos en los tejidos pulmonares tras la exposición a DEP o APM. Portaobjetos de pulmones teñidos con H&E representativos obtenidos de ratones inculcados con el vehículo, DEP o APM. Las flechas negras y rojas indican macrófagos alveolares de pigmento de partículas e infiltración de células inflamatorias, respectivamente. Partículas de escape diésel DEP, partículas artificiales APM, hematoxilina y eosina H&E.

Portaobjetos de pulmones teñidos con MT y PAS representativos obtenidos de ratones inculcados con vehículo y APM. La flecha negra indica hiperplasia de células mucosas. Tinción tricrómica de MT Masson, PAS Ácido peryódico-Schiff, APM material particulado artificial.

Determinamos perfiles de expresión génica alterados por DEP o APM e identificamos términos de ontología génica (GO) para comparar los cambios relacionados con el daño en la expresión génica inducida en respuesta al tratamiento con DEP y APM. El perfil transcriptómico mostró patrones de expresión génica diferenciales en los grupos de instilación de DEP y APM y mostró una mayor sensibilidad a las alteraciones genéticas en el último que en el primero. En total, se identificaron 257, 341 y 1794 expresión diferencial de genes (DEG) para la exposición a DEP, mientras que se identificaron 849, 1176 y 1842 DEG para la exposición a APM en las tres dosis correspondientes. Entre estos, 40 y 400 genes que se alteraron comúnmente en las tres dosis se identificaron en la exposición a DEP y APM, respectivamente. Entre estos, se seleccionaron 31 y 242 genes que mostraban cambios en la expresión relacionados con la dosis en los grupos DEP y APM, respectivamente. También identificamos 31 genes comúnmente alterados en los grupos de exposición a DEP y APM para identificar nuevos biomarcadores para la lesión pulmonar alterada por PM. Los 10 genes principales con los cambios de pliegue más altos fueron Gpnmb, Trem2, Clec4d, Slc26a4, Ear6, Cxcl5, Slc39a2, Cd300lf, Cxcr1 y Nup62-il4i1. La expresión de nueve genes (Gpnmb, Trem2, Clec4d, Slc26a4, Ear6, Cd300lf, Ctsd, Ptgir y Tacc3) fue mayor en el grupo APM que en el grupo DEP. Los genes modulados estadísticamente en los grupos DEP y APM se clasificaron a través de procesos biológicos GO (BP), rutas de la Enciclopedia de Kioto para genes y genomas (KEGG) y análisis de enfermedades para analizar los mecanismos moleculares relacionados con la exposición a PM. Las vías clave de BP y KEGG que fueron modificadas estadísticamente por DEP y APM (valor de p de la prueba exacta de Fisher < 0,05) se muestran en la Tabla 2. En total, 17 vías BP y 5 vías KEGG se enriquecieron estadísticamente en los grupos de exposición a DEP, y 99 vías BP y 15 vías KEGG se enriquecieron estadísticamente en los grupos de exposición a APM. El análisis GO mostró que los genes alterados por APM estaban vinculados a más BP y vías que los genes alterados por DEP. Los genes alterados por DEP se relacionaron principalmente con respuestas inflamatorias, incluida la regulación positiva de la cascada de quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) 1 y ERK2, la respuesta al factor de necrosis tumoral y la vía de señalización de quimioquinas (Tabla 2). Los genes alterados por APM se relacionaron con respuestas inflamatorias, procesos fagocíticos y procesos profibróticos debido a su participación en la regulación de varias vías de señalización, incluida la regulación positiva de la cascada ERK1 y ERK2, la regulación positiva de NF-kappaB (NF-κB) actividad del factor de transcripción, regulación positiva de la señalización de la proteína quinasa B, regulación positiva de la cascada de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK), respuesta celular al factor de necrosis tumoral, regulación positiva de la fagocitosis, regulación positiva de la proliferación de células del músculo liso, respuesta celular al crecimiento de fibroblastos factor de estímulo y vía de señalización del receptor tipo Toll (Tabla 2).

Finalmente, los genes alterados por PM se analizaron más a fondo utilizando la base de datos de toxicogenómica comparativa (CTD) para dilucidar las implicaciones de los genes alterados en las enfermedades pulmonares y otros trastornos. Los genes 31 y 242 que mostraron cambios en la expresión relacionados con la dosis en los grupos de exposición a DEP y APM, respectivamente, se asociaron con varias enfermedades relacionadas con las vías respiratorias, con un mayor número de enfermedades respiratorias asociadas con genes alterados por APM. 31 genes alterados por DEP estaban relacionados con enfermedades del tracto respiratorio, hipersensibilidad respiratoria y enfermedades bronquiales, y 242 genes alterados por APM estaban relacionados con enfermedades del tracto respiratorio, enfermedades pulmonares, neumonía, infecciones del tracto respiratorio, neoplasias pulmonares y neoplasias del tracto respiratorio. 3). Como se muestra en las Tablas 2 y 3, los números en CTD y genes anotados fueron más altos en el grupo APM que en el grupo DEP. En el análisis transcriptómico, nuestros resultados mostraron que la exposición a APM indujo la expresión de más DEG que la exposición a DEP en los pulmones de ratones, y una mayor expresión de APM indujo una mayor gravedad de las enfermedades pulmonares al estar involucrado en varios BP que la exposición a DEP.

Las PM, una mezcla compleja de sustancias orgánicas e inorgánicas sólidas y/o líquidas, se consideran un factor de riesgo ambiental. La evidencia acumulada sugiere que el PM está relacionado con enfermedades respiratorias, como la EPOC, el asma, la fibrosis e incluso el cáncer. Actualmente, para estudiar los riesgos para la salud de la exposición a PM en los pulmones, muchos investigadores han utilizado DEP, ya que es difícil obtener resultados científicos reproducibles debido a la diversidad de PM por estación, región y fuente. Además, también lleva mucho tiempo recolectar PM natural para investigar su toxicidad en estudios con animales y células. Sin embargo, debido a los altos costos asociados con DEP, la información toxicológica, incluida la toxicidad por inhalación en altas concentraciones durante mucho tiempo, puede ser limitada. Además, excluyendo varios otros factores, solo se puede investigar la toxicidad de DEP. Por lo tanto, para superar estas limitaciones asociadas con DEP, generamos APM, analizamos sus componentes y comparamos los efectos respiratorios en ratones instilados con DEP y APM para confirmar su aplicabilidad a la investigación toxicológica. Además, realizamos un análisis transcriptómico para explicar los cambios patológicos causados ​​por la exposición a DEP y APM en ratones.

Seleccionamos DEP, que ha sido ampliamente utilizado en estudios toxicológicos, como un componente principal de PM2.5. En un estudio anterior, comparamos el tamaño de las partículas y las morfologías entre DEP y APM. APM es más pequeño que el tamaño DEP18,19. DEP y APM son esféricos y están compuestos por aglomerados irregulares y morfologías típicas de partículas de hollín diesel, respectivamente18,19.

En primer lugar, en este estudio analizamos los PAH y los ratios OC/EC en APM y DEP. Los índices PAH y OC/EC están asociados con la inducción y exacerbación de enfermedades pulmonares8,9,10,11,12,13,14,15. Nuestros resultados mostraron que los niveles de PAH eran más altos en APM que en DEP, y que la relación OC/EC era similar entre DEP y APM (fig. 1). Los PAH emitidos por fuentes antropogénicas en el aire ambiente se clasifican como cancerígenos o probablemente cancerígenos para los humanos en la IARC. Los HAP ambientales se asocian con el desarrollo de cáncer de pulmón20,21,22,23,24 y efectos no cancerígenos como disminución de la función pulmonar, exacerbación del asma y aumento de la morbilidad y mortalidad por enfermedades pulmonares obstructivas25,26,27. Presumimos que APM podría causar enfermedades pulmonares con mayor gravedad que DEP, según el tamaño de partícula y la proporción de PAH. En este estudio, realizamos un estudio en animales para identificar y comparar los efectos respiratorios de la DEP midiendo el peso corporal durante el período experimental, el peso de los órganos, los cambios celulares, los niveles de citoquinas inflamatorias en BALF y los cambios histológicos en los pulmones de DEP- o Ratones instilados con APM. Hemos demostrado previamente que DEP indujo inflamación pulmonar dominante neutrofílica en un grupo instilado con DEP de 100 μg/ratón (5 mg/kg)28,29,30. En base a esto, la dosis más alta de DEP y APM se seleccionó como 5 mg/kg. En este estudio, los ratones fueron expuestos intratraquealmente a DEP y APM. En el grupo al que se instiló DEP o APM, se observó un peso pulmonar relativo significativamente mayor en comparación con el del grupo VC (Fig. 2). El peso pulmonar aumentado indica un aumento de la permeabilidad vascular y la infiltración de células inflamatorias en los sitios pulmonares lesionados31. En este estudio, aunque los eosinófilos se infiltraron estadísticamente en BALF del único grupo de APM, la proporción de varias células inflamatorias como macrófagos, neutrófilos y linfocitos aumentó significativamente en BALF de ratones instilados con DEP y APM (Fig. 2) . Estos resultados pueden estar relacionados con el aumento del peso pulmonar de los ratones a los que se instiló DEP o APM. También verificamos varias proteínas inflamatorias en el BALF de ratones instilados con DEP y APM. ELISA mostró que los niveles de citoquinas inflamatorias como IL-6, TNF-α, MCP-1 y CXCL1/KC en BALF aumentaron en BALF de ratones instilados con DEP y APM. Estos niveles de proteína fueron particularmente más altos en el BALF de ratones expuestos a APM que en ratones expuestos a DEP (Fig. 2). El nivel de proteína de IL-5 aumentó gradualmente en los grupos BALF de DEP sin ningún cambio estadísticamente significativo, mientras que este nivel aumentó significativamente solo en el grupo APM. MCP-1 es una quimiocina clave que juega un papel crucial en la regulación de la migración y el reclutamiento de monocitos/macrófagos32. IL-6 y TNF-α se liberan de los macrófagos alveolares pigmentados con PM y participan en las respuestas inflamatorias33. MCP-1, IL-6 y TNF-α son quimiocinas o citocinas clave involucradas en enfermedades pulmonares, incluidas el asma y la EPOC. La quimiocina, CXCL1/KC, juega un papel crucial en la inflamación aguda, ya que es el principal quimioatrayente responsable del reclutamiento de neutrófilos. La IL-5 producida a partir de células CD4+ Th2, mastocitos, eosinófilos y basófilos es el modulador más potente de la acumulación de eosinófilos durante respuestas alérgicas como el asma34. De acuerdo con estos resultados, en las evaluaciones histológicas, la infiltración de células inflamatorias mixtas en las regiones perivasculares se observó comúnmente en los pulmones de los grupos DEP y APM (Fig. 3, Tabla 1). Sin embargo, se observó inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar e hiperplasia mucosa en algunos ratones de los grupos APM únicos (Fig. 4, Tabla 1). Estos resultados indicaron que tanto DEP como APM indujeron inflamación pulmonar acompañada de infiltración de células inflamatorias mixtas, lo que puede inducir una lesión pulmonar más grave que DEP según la gravedad de la infiltración de células inflamatorias y los niveles de citoquinas.

A continuación, identificamos los patrones de expresión génica en los pulmones expuestos a DEP y APM para comprender los cambios asociados a la lesión en la expresión génica y los mecanismos relacionados, y nos centramos en la expresión génica y el análisis GO para dilucidar los cambios patológicos comunes y las diferentes gravedades de la lesión pulmonar en DEP. - o ratones instilados con APM. Encontramos que los cambios transcriptómicos causados ​​por la exposición a APM fueron mucho más sensibles que los debidos a la exposición a DEP, induciendo la expresión de los genes 242 y 31, respectivamente, de manera dependiente de la dosis. Además, identificamos 31 genes comunes anotados por la exposición a DEP y APM para abordar los cambios patológicos comúnmente observados por la exposición a DEP o APM en un modelo in vivo. Los 10 genes principales con los cambios de pliegue más altos entre los 31 genes comunes en los grupos DEP y APM fueron Gpnmb, Trem2, Clec4d, Slc26a4, Ear6, Cxcl5, Slc39a2, Cd300lf, Cxcr1 y Nup62-il4i1. Entre ellos, nueve genes (Gpnmb, Trem2, Clec4d, Slc26a4, Ear6, Cd300lf, Ctsd, Ptgir y Tacc3) aumentaron en el grupo APM en relación con el grupo DEP de manera dependiente de la dosis. Los nueve genes principales tienen funciones importantes en la inflamación pulmonar, el asma, la EPOC, la fibrosis pulmonar y el cáncer de pulmón35,36,37,38,39,40,41,42,43. En este estudio, observamos inflamación pulmonar común en los grupos DEP y APM a través de la evaluación histológica, y la gravedad fue mayor en el grupo APM en relación con el grupo DEP. Las características patológicas, que incluyen inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar e hiperplasia de células mucosas, se observaron solo en los pulmones del grupo APM. Por lo tanto, nuestros resultados indicaron que los niveles alterados de expresión génica podrían influir en la gravedad de la lesión pulmonar inducida por DEP y APM.

Las vías clave de BP y KEGG afectadas significativamente por la exposición a DEP y APM se presentan en la Tabla 2. Los genes alterados por DEP y APM comúnmente están vinculados a respuestas inmunitarias e inflamatorias, incluidos los procesos de oxidación-reducción, angiogénesis, regulación positiva de la cascada ERK1 y ERK2 , quimiotaxis y respuesta celular al factor de necrosis tumoral. Estos cambios en la expresión génica son consistentes con los resultados de los cambios celulares y el análisis de citoquinas en BALF, mostrando un aumento en los niveles de macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, linfocitos y varias citoquinas, incluyendo IL-5, IL-6, TNF-α, MCP-1 y CXCL1 (Fig. 2). Los genes se analizaron más a fondo utilizando el CTD para dilucidar las relaciones gen-enfermedad alteradas por la instilación de DEP y APM dentro de la categoría de enfermedad del tracto respiratorio. De manera dependiente de la dosis, 31 genes comunes en los grupos DEP estuvieron involucrados en diversas enfermedades relacionadas con las vías respiratorias (es decir, enfermedades de las vías respiratorias, hipersensibilidad respiratoria y enfermedades bronquiales; Tabla 3), y 242 genes comunes en los grupos APM fueron relacionadas con diversas enfermedades relacionadas con las vías respiratorias (es decir, enfermedades de las vías respiratorias, enfermedades pulmonares, neumonía, infecciones de las vías respiratorias, neoplasias pulmonares y neoplasias de las vías respiratorias; Tabla 3). De manera similar a las características patológicas observadas en los ratones a los que se instiló DEP o APM, los genes alterados observados en el grupo APM estaban involucrados en más BP y enfermedades en comparación con DEP. Estos resultados indicaron que la exposición a APM es más sensible a los cambios de expresión génica relacionados con la lesión pulmonar que la exposición a DEP.

Además, analizamos y comparamos los BP clave entre la exposición a DEP y APM, centrándonos en el asma porque las características asmáticas, incluida la infiltración de eosinófilos y el aumento de la producción de IL-5, mejoraron significativamente en el BALF del grupo APM. Además, se observó hiperplasia mucosa en los pulmones del grupo APM pero no en el grupo DEP. El asma se produce debido a factores genéticos y ambientales como el tabaquismo, diversos alérgenos y contaminantes44 y es una enfermedad pulmonar crónica caracterizada por infiltración de eosinófilos, aumento de la producción de citocinas Th2, aumento de la producción de inmunoglobulina E (IgE) a partir de células B, aumento de los vasos sanguíneos, aumento del volumen del músculo liso de las vías respiratorias y producción excesiva de moco en las vías respiratorias45,46 a través de múltiples vías, incluidas MAPK y NF-κB46,47. En el perfil transcriptómico, mediante la comparación de los PA clave entre los grupos DEP y APM, los indicadores representativos del asma, incluidas las respuestas inflamatorias, la quimiotaxis, la regulación positiva de la proliferación de células del músculo liso, la regulación positiva del proceso biosintético del óxido nítrico, la regulación positiva de la diferenciación de células endoteliales, la respuesta a El interferón-γ, la diferenciación de células T involucradas en las respuestas inmunes a través de la regulación positiva de la cascada ERK1 y ERK2, la regulación positiva de la señalización de la proteína quinasa B y la regulación positiva de la cascada MAPK se identificaron solo en los grupos APM. Estos resultados mostraron que la exposición a APM podría inducir características asmáticas en el análisis transcriptómico y en los resultados patológicos de los estudios in vivo.

Finalmente, en nuestro estudio, generamos APM de aproximadamente 30 nm, que pertenece a partículas finas con un diámetro de menos de 100 nm. Incluyen gran proporción en la atmósfera. En Tiangin, China, a principios del verano de 2018, las partículas finas constituyeron el 33 % de las partículas ambientales, en promedio48. La Unión Europea ha revelado que entre el 70 y el 80 % de las partículas de la atmósfera tenían un diámetro pequeño, inferior a 100 nm49. Cuando las PM pequeñas se expusieron en los pulmones, se depositaron desde la faringe hasta los alvéolos, porque la vía respiratoria depende del tamaño50. El tamaño más pequeño induce el riesgo del sistema respiratorio, del sistema cardiovascular y de todos los órganos porque pueden pasar fácilmente a través de los capilares50. Confirmamos estas partículas finas en pulmón, corazón, riñones y bazo debido al tamaño pequeño de APM después de la instilación de APM en los pulmones (no se muestra) en otro estudio. Por lo tanto, nuestro APM podría ser adecuado y útil para investigar los efectos adversos de las partículas finas, incluidos el inicio, el desarrollo y la exacerbación de enfermedades, incluidos los pulmones y otros órganos y mecanismos relacionados.

El estudio actual tiene algunas limitaciones. Primero, es necesario analizar la composición de APM y compararla con la composición de PM en el aire, para establecer un modelo animal que refleje varios componentes de PM y usarlo para estudios toxicológicos. En segundo lugar, en este estudio, DEP y APM se trataron en una ruta intratraqueal. Este método es una alternativa a la inhalación y puede revelar una distribución diferente en los pulmones. Por lo tanto, se necesitan más estudios sobre la inhalación para probar la toxicidad de PM y demostrar su mecanismo de acción en la lesión pulmonar por inhalación de PM u otros trastornos que usan APM.

A pesar de estas limitaciones, las observaciones actuales han revelado que el modelo animal expuesto a APM podría ayudar a estudiar los efectos adversos para la salud de PM en los pulmones al mostrar que APM puede inducir diversas enfermedades pulmonares mediante la regulación de dosis.

Este estudio estableció un modelo animal de enfermedades pulmonares inducidas por PM utilizando APM generado en laboratorio. Nuestros resultados mostraron que tanto DEP como APM indujeron lesiones pulmonares inflamatorias. Sin embargo, la gravedad fue mayor en el grupo APM en relación con el grupo DEP. En el pulmón de ratones expuestos a DEP, solo se observó una ligera inflamación pulmonar. Curiosamente, APM indujo varias enfermedades pulmonares, incluida una inflamación pulmonar leve, inflamación granulomatosa, fibrosis pulmonar y asma según diferentes dosis de APM en ratones. De acuerdo con estos resultados, el perfil de genes transcriptómicos mostró que los genes alterados por APM estaban involucrados en más BP, vías y enfermedades relacionadas con lesiones que DEP. Por lo tanto, sugerimos que un modelo animal inculcado con APM tiene el potencial para estudiar el mecanismo biológico molecular de las enfermedades pulmonares inducidas por PM de acuerdo con varios cambios de concentración, lo que ayuda a desarrollar estrategias preventivas y terapéuticas contra las enfermedades pulmonares relacionadas con PM.

Se mantuvieron ratones C57BL/6 macho de siete semanas de edad (Orient Bio, Seongnam, Corea) con un peso de 20,31 ± 0,67 g en temperatura controlada (22 ± 3 °C) y humedad (50 ± 20 %) con una luz de 12 h/12 ​​h. ciclo oscuro (150–300 Lux) y libre acceso a alimentos y agua del grifo. Los ratones alojados en una sola casa se aclimataron durante 3 días y no mostraron signos clínicos adversos ni aumento de peso normal. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto de Toxicología de Corea (n.º 2105-0030 y n.º 2108-0032) y se realizaron de acuerdo con las pautas ARRIVE51.

Los ratones se emparejaron por peso y se separaron aleatoriamente en siete grupos (n = 4 para el control del vehículo o n = 5 para otros grupos) utilizando el programa de software Pristima v.7.3 para estudios preclínicos (Xybion Medical Systems Corporation, Morris Plains, NJ, EE. UU.). Los siete grupos fueron definidos por regímenes de exposición específicos de la siguiente manera: control de vehículos (VC) para agua destilada (DW) como control DEP y APM; DEP (SRM 2975; Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, Gaithersburg, MD, EE. UU.) para cada una de las tres dosis (1,25, 2,5 y 5 mg/kg), y APM para las tres dosis (1,25, 2,5 y 5 mg /kg). A las 24 h después de la última instilación al vehículo, DEP o APM, se realizaron mediciones de peso de órganos, análisis de cambios celulares y niveles de citocinas en líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y examen histológico junto con análisis transcriptómico de tejido pulmonar.

En nuestro estudio anterior, se produjo APM a base de negro de carbón a partir de grafito en diferentes rangos de temperatura, como temperatura ambiente, 200 °C, 400 °C, 600 °C y 800 °C18. En este estudio, se generó APM a partir de grafito a 600 °C y se combinó con etileno para aumentar el nivel de PAH. Brevemente, se usó un generador de aerosol DNP digital 3000 (Palas GmbH, Alemania) para generar PM artificial (APM). Bajo alto voltaje, se generó un salto de chispa entre dos electrodos de grafito a 600 °C. Después, el generador se mantuvo en un alto voltaje de 2500 V y 700 Hz entre los dos electrodos de grafito que suministraban gases co-mezclados con argón puro (99,999 %; 7 LPM) y aire (99,999 %; 10 LPM), combinado con etileno. El APM fue muestreado utilizando teflón filtrado con un tamaño de poro de 2 µm y un diámetro de 47 mm (R2PJ047, PALL Corporation; EE. UU.)18,19.

Se utilizaron soluciones de sacarosa de concentraciones variables para la calibración del equipo (N = 5, R2 = 1,00). En el muestreo de APM se utilizaron filtros de fibra de cuarzo (filtro QMA de 25 mm, Whatman Inc., EE. UU.) sin productos químicos orgánicos. Los componentes carbonosos en APM y DEP se analizaron utilizando un OC-EC Aerosol Analyzer Model 5 (Sunset Laboratory, Beaverton, Oregon, EE. UU.)19.

Entre los contaminantes prioritarios enumerados por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, se seleccionaron siete HAP como objetivos en este estudio, incluidos fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzo[a]pireno, indeno[1,2,3-c,d] pireno y benzo[g,h,i]perileno. Los estándares de PAH utilizados para la calibración y el aseguramiento de la calidad se prepararon diluyendo la mezcla de PAH EPA 610 (Supelco, St. Louis, MO, EE. UU.) con metanol52.

Los PAH y los n-alcanos en partículas se extrajeron mediante ultrasonidos con un disolvente de diclorometano dos veces durante 30 min. Los extractos se purificaron utilizando filtros de jeringa con un tamaño de poro de 0,2 μm. Las muestras de PAH de este estudio se analizaron con un instrumento QP-2010 ultra GC (Shimadzu, Japón) conectado a un instrumento QP2010 ultra MS (Shimadzu, Japón) con una columna capilar DB-5MS52. La información detallada se proporciona en la Tabla 4.

DEP y APM se dispersaron en una concentración de 2 mg/mL utilizando una sonda ultrasónica (VC 505, Vibra-Cell™ Ultrasonic Liquid Processors, Sonics & Materials, Inc., EE. UU.) durante 30 min.

El tracto respiratorio es la primera ruta de exposición a PM, y la administración intratraqueal se utilizó para establecer un modelo animal expuesto a PM para estudios toxicológicos respiratorios. En los días 1, 5, 8, 12 y 15, a los ratones se les administró por vía intratraqueal DEP o APM (1,25, 2,5 y 5 mg/kg) dispersos en 50 μl DW. Para la administración intratraqueal, los ratones se anestesiaron usando anestesia inhalada. Antes de la administración, el isoflurano se administró en la cámara del animal utilizando sistemas de anestesia portátiles para animales pequeños (L-PAS-02, LMSKOREA, Inc, Seongnam, Corea) equipados con vaporizador de isoflurano. Y luego, los ratones fueron expuestos a isoflurano al 2,5 % administrado en O2 (2 l/min) dentro de la cámara del animal hasta que se alcanzó un estado de sueño. Los ratones que recibieron anestesia con isoflurano se sacaron de la cámara de animales, los ratones se acostaron a bordo y la administración se realizó inmediatamente usando un instilador de video automático. Después de la administración, los ratones se movieron, se recuperaron por completo y se transfirieron a su jaula.

El día 16, se pesaron los pulmones, el bazo y el timo en ratones sacrificados.

A las 24 h después de la última instilación de DEP y APM, se ligó el pulmón izquierdo y se lavó lentamente el pulmón derecho tres veces utilizando el tubo traqueal con 0,7 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). El número de células totales en el BALF se midió utilizando un contador NC-250 (ChemoMetec, Gydevang, Dinamarca). Para analizar las células diferenciales, se realizaron frotis celulares utilizando un equipo Cytospin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se cargaron con solución Diff-Quik (Dade Diagnostics, Aguada, Puerto, EE. UU.). Después del lavado, se montaron los portaobjetos. Se contaron un total de 200 células por portaobjetos. Además, para medir los niveles de citoquinas, el BALF se centrifugó a 2000 rpm durante 5 min y se recogieron los sobrenadantes.

A las 24 h después de la última instilación de DEP y APM, los tejidos pulmonares extraídos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% (v/v). Para la preparación del portaobjetos, los tejidos pulmonares se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 4 μm. Antes de la tinción, las secciones se desparafinizaron con xileno. Estos se tiñeron con soluciones de hematoxilina y eosina (H&E; Sigma-Aldrich), ácido peryódico de Schiff (PAS; Sigma-Aldrich) y tricrómico de Masson (MT; Sigma-Aldrich). Las secciones teñidas se analizaron bajo un microscopio óptico (Axio Imager M1; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se puntuó el grado de lesión53,54.

El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen). La calidad y la cantidad de ARN se midieron en un bioanalizador Agilent 2100 con el nanochip RNA 6000 (Agilent Technologies, Amstelveen, Países Bajos) y el espectrofotómetro ND-2000 (Thermo Inc., DE, EE. UU.), respectivamente. Para el análisis se utilizaron muestras de ARN con una relación A260/A280 > 1,8 y un valor de número de integridad de ARN (RIN) > 7.

En primer lugar, la biblioteca se construyó utilizando el kit de preparación de biblioteca QuantSeq 3' mRNA-Seq (Lexogen, Inc., Austria) según las instrucciones del fabricante para analizar las muestras de control y de prueba. Un cebador oligo-dT, que incluía una secuencia compatible con Illumina en su extremo 5ʹ, se hibridó con los 500 ng de ARN total y se transcribió de forma inversa. Cuando se degradó la plantilla de ARN, se inició la síntesis de la segunda cadena mediante un cebador aleatorio, que incluía una secuencia enlazadora compatible con Illumina en su extremo 5ʹ. Después de purificar la biblioteca de doble cadena a través de perlas magnéticas, la biblioteca se amplificó para agregar las secuencias adaptadoras completas necesarias para la generación de grupos. La secuenciación de alto rendimiento se realizó como secuenciación 75 de extremo único en la plataforma NextSeq 500 (Illumina, Inc., EE. UU.), con la biblioteca final purificada por los componentes de la PCR.

En QuantSeq 3' mRNA-Seq lecturas alineadas por Bowtie2, los índices de Bowtie2 se generaron a partir de la secuencia de ensamblaje del genoma o de las secuencias de transcripción representativas para la alineación con el genoma y el transcriptoma. Los archivos de alineación se usaron para ensamblar transcripciones, estimar su abundancia y detectar los DEG. Los datos de DEG y RC (recuento de lectura) se procesaron en función de los recuentos de alineaciones únicas y múltiples a través de la cobertura en Bedtools55 y en el método de normalización de cuantiles a través de EdgeR dentro de R usando Bioconductor56, respectivamente. La base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov/) y las bases de datos de Medline (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se utilizaron para la clasificación de genes.

Para clasificar y comparar los genes alterados por DEP y APM en grupos de animales con patrones de toxicidad pulmonar similares, cada gen se asignó a categorías adecuadas según su función celular principal. Para realizar el análisis transcriptómico, los DEG se definieron bajo una combinación de cambio de pliegue ≥ 1,5 y valor de p < 0,05. DAVID y el análisis de vías se utilizaron para determinar los términos GO sobrerrepresentados de manera significativa y para determinar las vías significativas para DEG de la base de datos KEGG (http://www.genome.jp/kegg/), respectivamente. La identificación del enriquecimiento sustancial de la vía y los valores de p se ajustaron mediante la prueba exacta de Fisher y el algoritmo de tasa de descubrimiento falso (FDR) de BH, respectivamente. Las categorías de vías se informaron con FDR < 0,05. Además, se usó el CTD (http://ctdbase.org) para analizar las interacciones entre enfermedades y genes por exposición a DEP y APM en ratones. En este estudio, se identificaron y analizaron los genes que se alteraron con la exposición a DEP o APM de manera dependiente de la dosis.

Los datos se expresaron como la media ± (DE). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Se examinó la varianza en la homogeneidad de los datos mediante la prueba de Brown-Fosythe o la prueba de Bartlett. Los datos homogéneos se analizaron mediante el análisis de varianza y las comparaciones estadísticas se realizaron mediante el análisis de varianza unidireccional, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Un valor de p < 0,05 indicó significación estadística.

Los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo los protocolos aprobados por la IACUC del Instituto de Toxicología de Corea (n.º 2105-0030 y n.º 2108-0032) y se realizaron de acuerdo con todas las directrices y reglamentos.

Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

Procesos biológicos

Base de datos de toxicogenómica comparativa

Expresión diferencial de genes

Partículas de escape diésel

Agua destilada

carbono elemental

Quinasa regulada por señal extracelular

Tasa de descubrimiento falso

Ontología de genes

Hematoxilina y eosina

Comité institucional de cuidado y uso de animales

Enciclopedia de Kyoto para genes y genomas

Proteína quinasa activada por mitógeno

Tricrómico de Masson

NF-kappaB

Carbón orgánico

Hidrocarburo aromático policíclico

Solución salina tamponada con fosfato

Materia particular

Conteo de lecturas

Número de integridad del ARN

Desviación Estándar

Control de vehículos

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Toxicología de Corea (Subvención No. KK-2203), el Programa Institucional KIST (Programa de Investigación del Medio Ambiente Atmosférico, Subvención Nos. SK-2204; 2E31700-22-P008) y Bio & Medical Technology Deveolopment Programa de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) (No. 2022M3A9E4082651).

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Dong Im Kim, Mi-Kyung Song, Ji Eun Yuk, Hyeon Jin Seo y Kyuhong Lee

Departamento de Toxicología Humana y Ambiental, Universidad de Ciencia y Tecnología, Daejeon, 34113, República de Corea

Mi-Kyung Song y Kyuhong Lee

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DIK diseñó el estudio, realizó los experimentos con modelos de ratones, los trabajos moleculares, incluidos los recuentos de células y los niveles de proteína e IgE, interpretó los datos y escribió el manuscrito. M.-KS analizó el perfil transcriptómico y editó el manuscrito. JEY realizó los experimentos modelo de ratón. HJS analizó la relación OC/EC y el nivel de PAH. KL interpretó los datos, editó el manuscrito y supervisó este estudio. Todos los autores contribuyeron a la edición del manuscrito. Todos los autores leyeron y revisaron el manuscrito final.

Correspondencia a Kyuhong Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kim, DI, Song, MK., Yuk, JE et al. Establecimiento de un modelo de enfermedad pulmonar inducida por material particulado artificial mediante el análisis de cambios patológicos y perfiles transcriptómicos en ratones. Informe científico 13, 5955 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29919-9

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Recibido: 03 noviembre 2022

Aceptado: 13 febrero 2023

Publicado: 12 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29919-9

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