La exposición al ozono interrumpe la comunicación sexual de los insectos

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1186 (2023) Citar este artículo

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La comunicación sexual de los insectos a menudo depende de las feromonas sexuales. La mayoría de las feromonas de insectos, sin embargo, contienen dobles enlaces carbono-carbono y se degradan potencialmente por oxidación. Aquí, mostramos que los niveles elevados de ozono antropocénico informados con frecuencia pueden oxidar todas las feromonas específicas masculinas descritas de Drosophila melanogaster, lo que da como resultado cantidades reducidas de feromonas como cis-Vaccenyl Acetate y (Z)-7-Tricosene. Al mismo tiempo, la aceptación por parte de las hembras de los machos expuestos al ozono se retrasa significativamente. Curiosamente, los grupos de machos expuestos al ozono también exhiben niveles significativamente mayores de comportamiento de cortejo macho-macho. Al repetir experimentos similares con otras nueve especies de drosófilos, observamos degradación de feromonas y/o reconocimiento sexual interrumpido en ocho de ellas. Nuestros datos sugieren que los niveles antropocénicos de ozono pueden oxidar extensamente los dobles enlaces en una variedad de feromonas de insectos, lo que lleva a desviaciones en el reconocimiento sexual.

Encontrar y juzgar a una pareja adecuada es fundamental para la reproducción en muchos animales. En este contexto, la mayoría de los insectos utilizan feromonas sexuales para discriminar a los conespecíficos de los aloespecíficos y para identificar el sexo y el estado de apareamiento de una pareja potencial1,2,3. Una feromona particularmente bien investigada es el acetato de cis-vaccenilo (cVA). Este compuesto es producido por el macho Drosophila melanogaster, rige el reconocimiento del sexo y se ha demostrado que la cantidad de cVA presente en un macho se correlaciona con el atractivo del macho para una hembra4,5,6,7. Sin embargo, durante la cópula, el macho, para asegurar su paternidad, transfiere cVA a la hembra y, por lo tanto, reduce el atractivo de la hembra para otros machos6,8,9. cVA es, por lo tanto, atractivo para las mujeres pero repulsivo para los hombres. Se sabe que muchas especies de moscas del género Drosophila producen compuestos específicos masculinos que aumentan su atractivo hacia las hembras conespecíficas, se transfieren durante la cópula y, por lo tanto, parecen cumplir funciones similares a las feromonas como cVA en Drosophila melanogaster10,11. Aunque son químicamente diversas, la mayoría de estas feromonas potenciales comparten una característica específica: contienen enlaces dobles de carbono.

Durante el Antropoceno, los insectos que se comunican con estas feromonas insaturadas se enfrentan a un desafío potencial: la oxidación de los dobles enlaces por el aumento de los niveles de contaminantes oxidantes como el ozono12. Los sistemas de feromonas han evolucionado en tiempos preindustriales con valores de ozono troposférico tan bajos como 10 ppb13. Sin embargo, debido a la emisión continua de óxidos de nitrógeno (NOx), compuestos orgánicos volátiles (COV) y el cambio climático, el nivel de ozono ya ha aumentado a un promedio mundial anual de 40 ppb14. Se han informado eventos locales extremos de ozono en áreas industriales y urbanas de, por ejemplo, México, Bangladesh, Marruecos y China15,16,17,18. El ozono alcanzó en México una concentración de hasta 210 ppb (que duró una hora) y el valor medio más alto medido en 10 h superó las 170 ppb15. Aunque los valores de ozono varían mucho durante todo el año, el promedio anual medido para, por ejemplo, el noreste de China aumentó de 45 ppb en 2003 a 62 ppb en 201516 y alcanzó un máximo diario promedio durante 8 h (MDA8) de 140 ppb observados en marzo de 202019.

Aquí mostramos que incluso la exposición a corto plazo a niveles de ozono de 100 ppb da como resultado la degradación de muchas feromonas drosófilas y reduce, por ejemplo, el atractivo de los machos para las hembras en 7 de 10 especies probadas. Curiosamente, la exposición al ozono aumenta drásticamente el comportamiento de cortejo entre hombres, probablemente debido a la falta de discriminación sexual cuando las feromonas masculinas se degradan.

Primero investigamos si la cantidad de cVA de los machos de D. melanogaster (CS) se ve afectada por la exposición al ozono. De hecho, al comparar con moscas de control expuestas al aire ambiente (con 4,5 ± 0,5 ppb de ozono), encontramos cantidades reducidas de cVA en moscas que estuvieron expuestas a 100 ppb de ozono durante 2 h (Fig. 1, para un esquema del ozono configuración ver Fig. S1) y mayores cantidades de heptanal (Fig. S2), un producto de descomposición potencial de la oxidación de cVA. Curiosamente, muchos otros compuestos de feromonas como (Z)-7-Tricosene (7-T) y (Z)-7-Pentasene (7-P)20, que se sabe que están involucrados en el comportamiento reproductivo, disminuyeron después de la exposición al ozono. también (Fig. 1c).

a Dibujo esquemático del protocolo analítico TDU GC-MS. Las moscas macho fueron expuestas primero al ozono o al aire ambiente. Su perfil químico fue luego analizado por TDU GC-MS. b Perfiles químicos de machos de D. melanogaster después de la exposición al ozono (rosa) o al aire ambiente (gris). Cromatogramas (panel izquierdo), estructuras químicas de feromonas masculinas e hidrocarburos cuticulares, CHC (panel derecho). c, Análisis cuantitativo de feromonas masculinas y CHC. (Prueba t no pareada de dos colas; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego preguntamos si estos cambios en los perfiles químicos de los machos afectarían su atractivo para las moscas hembra. Por lo tanto, expusimos a las moscas macho durante 30 minutos a ozono que oscilaba entre 50 y 200 ppb o, como control, al aire ambiente y luego probamos su comportamiento de cortejo y éxito de apareamiento con hembras no expuestas en un ensayo de apareamiento sin elección (Fig. 2a). Los machos expuestos al ozono no difirieron de los machos de control con respecto a su latencia de cortejo (es decir, el tiempo hasta que comenzaron a cortejar a la hembra; Fig. 2a) y el porcentaje de cortejo (es decir, el porcentaje de machos que cortejaban a las hembras, Fig. S3) , lo que demuestra que la motivación de cortejo masculino no parece verse afectada por la exposición previa al ozono. Al mismo tiempo, aunque la mayoría de los machos finalmente se aparearon dentro de los 10 minutos de observación (Fig. S3), los machos expuestos al ozono exhibieron una latencia de apareamiento más prolongada que los machos de control (es decir, necesitaron más tiempo para ser aceptados por la hembra; Fig. 2a) . Nuestros resultados indican que los machos expuestos al ozono eran menos atractivos para las hembras cortejadas, lo que se corresponde bien con la reducción de feromonas antes mencionada tras la exposición al ozono. No observamos ningún efecto del ozono cuando las moscas estuvieron expuestas solo durante 15 minutos, mientras que la latencia de apareamiento de los machos aumentó nuevamente después de la exposición al ozono durante dos horas o después de la exposición a niveles más altos de ozono (150 ppb y 200 ppb) (Fig. S4). Curiosamente, después de estar expuestos al ozono durante 2 h, los machos no recuperaron su perfil químico original ni su atractivo para las hembras después de 1 día, pero exhibieron niveles normales de feromonas y atractivo después de 5 días (Fig. S5).

a Latencia de cortejo macho/hembra y latencia de apareamiento después de la exposición del macho a diferentes niveles de ozono (tamaño de la muestra entre paréntesis, prueba de Dunnett para comparaciones múltiples contra el control del aire ambiental; grupos que difieren significativamente del control: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). b Comportamiento de cortejo macho/macho después de que ambos machos hayan estado expuestos al ozono. latencia de cortejo, prueba de Dunnett para comparaciones múltiples; porcentaje de cortejo (porcentaje de experimentos que resultaron en cortejo de machos), prueba exacta de Fisher con corrección de Holm-Bonferroni para comparación múltiple con grupo control; diferencias significativas con el control representado como se muestra arriba. c Curva de respuesta a la dosis SSR de la neurona Or67d (at1 sensillum) de D. melanogaster macho. Panel superior, esquema del procedimiento SSR; datos presentados como media ± SE, N = 10 para exposición al aire o al ozono (prueba t para cada concentración; NS indica que no hay diferencia significativa). El aceite mineral (MO) sirvió como control de disolvente. d Comportamiento de cortejo de un macho intacto de D. melanogaster hacia un macho decapitado. Los machos intactos, decapitados o ambos fueron expuestos al ozono antes del ensayo de cortejo. Porcentaje de cortejo (ver arriba), prueba exacta de Fisher con corrección de Holm-Bonferroni para comparación múltiple; índice de cortejo (cantidad de tiempo que el macho intacto cortejó durante el experimento), prueba de Tukey para comparaciones múltiples. e La preferencia de una mosca macho por un macho o una hembra decapitados. El macho decapitado, la hembra o ambas moscas decapitadas se expusieron al ozono antes del ensayo de cortejo. Primera opción presentada en gráficos circulares (prueba exacta de Fisher); Índice de preferencia (tiempo de cortejo femenino - tiempo de cortejo masculino) / tiempo total de cortejo, prueba t no pareada para preferencia de cortejo. Todas las pruebas son de dos colas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como se mencionó anteriormente, las feromonas específicas para hombres a menudo no solo funcionan como afrodisíacos para las mujeres, sino que también ayudan a los hombres a discriminar sexos6,7. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la exposición al ozono de las moscas macho, con la subsiguiente reducción de sus feromonas específicas de macho, impediría la discriminación sexual. Sin embargo, cuando expusimos a grupos de machos a 100 ppb de ozono, los resultados superaron nuestras expectativas. Después de un breve período (17,72 ± 1,83 min, N = 10) de exposición, los machos comenzaron a cortejarse entre sí intensamente y a exhibir un comportamiento de encadenamiento (vídeo complementario S1 y S2), es decir, formaron una larga cadena de cortejo de machos que fue primero descrito para machos portadores de una mutación infructuosa, es decir, una mutación en el gen infructuoso que cambia las preferencias de apareamiento de los machos21. Al cuantificar dicho comportamiento de cortejo macho-macho de pares de machos expuestos al ozono (es decir, 30 min a 100 ppb) en un ensayo de no elección (Fig. 2b), encontramos un mayor número de ensayos que resultaron en cortejo masculino como en comparación con los machos de control expuestos al aire. Nuevamente, el efecto del ozono podría incrementarse ya sea prolongando el tiempo de exposición o aumentando el nivel de ozono (Fig. S6). Dado que ambos machos estuvieron expuestos al ozono en estos experimentos, nos preguntamos si el aumento observado en el cortejo macho-macho se debió únicamente a las feromonas específicas masculinas degradadas, o si además se vio afectado por un posible mal funcionamiento de las neuronas sensoriales, responsables de su detección. , debido al estrés oxidativo. Las grabaciones de sensillum individuales (SSR) de sensilla tricoide antenal at1, que se sabe que albergan una neurona sensorial olfativa que detecta cVA7, revelaron curvas de respuesta a la dosis similares en las moscas expuestas al ozono que en las moscas de control (Fig. 2c). Además, confrontamos a un macho intacto con un macho decapitado y expusimos a cada uno de ellos al ozono o al aire ambiente antes del encuentro. Descubrimos que si el macho intacto exhibiría o no un comportamiento de cortejo no estaba influenciado por su propia exposición al ozono, sino solo por la exposición del macho decapitado (Fig. 2d). En resumen, la exposición al ozono no impide la función de las neuronas sensibles a las feromonas u otros niveles de procesamiento de señales, sino que induce el cortejo entre hombres a través de la degradación de las feromonas. A continuación, preguntamos si la exposición al ozono impide por completo la discriminación sexual y analizamos la preferencia de cortejo de los machos no expuestos al ozono hacia un macho y una hembra decapitados en un ensayo de elección. Antes de la prueba, las moscas decapitadas se expusieron a ozono o aire de control. Mientras que los machos cortejaban preferentemente a las hembras en el experimento de control, la exposición al ozono de las moscas decapitadas dio como resultado un cortejo igualitario de moscas hembras y machos (Fig. 2e). Curiosamente, cuando solo el macho decapitado estuvo expuesto al ozono antes del experimento, la hembra decapitada todavía fue cortejada preferentemente en el ensayo de elección (Fig. 2e), lo que sugiere que los productos químicos específicos de la hembra son suficientes para la discriminación sexual. Como la exposición de ambos sexos al ozono impidió la discriminación sexual, también las señales femeninas parecen ser sensibles a la degradación por el ozono. De hecho, al analizar hembras expuestas al ozono (es decir, 2 h a 100 ppb), encontramos cantidades reducidas de los compuestos descritos específicos para hembras 7,11-heptacosadieno (7,11-HD) y 7,11-nonacosadieno (7,11-HD). 11-ND)22,23 (Fig. S7).

Habiendo demostrado que la exposición al ozono no solo reduce el atractivo de un macho de D. melanogaster (CS) hacia las hembras, sino que también compromete fuertemente la discriminación sexual, preguntamos si este efecto es específico de D. melanogaster (CS) o aparece en otras especies como Bueno. Con base en nuestro estudio anterior sobre compuestos específicos de machos en 99 especies de Drosophila11, seleccionamos otras 8 especies de Drosophila que se sabe que portan compuestos específicos de machos. Expusimos a sus machos durante 2 h a 100 ppb de ozono y comparamos sus perfiles químicos y comportamientos con los de los machos de control. Siete de estas especies, excepto D. buskii, exhibieron cantidades reducidas de compuestos específicos de machos después de la exposición al ozono (Fig. 3). Al mismo tiempo, todos ellos mostraron una disminución del éxito de apareamiento y/o cambios en las interacciones macho-macho (Fig. 3). Los compuestos específicos masculinos descritos por D. busckii no contienen dobles enlaces carbono-carbono y, por lo tanto, son menos sensibles a la degradación por el ozono (Fig. 3). Aunque también se han demostrado los efectos degradantes del ozono sobre los hidrocarburos cuticulares de moscas que carecen de dobles enlaces de carbono, esos experimentos se realizaron con concentraciones de ozono que con 45.000 ppm eran alrededor de 106 superiores a las utilizadas en nuestros experimentos24. El hecho de que los machos de D. buskii tuvieran aún menos éxito en el cortejo de las hembras podría deberse a compuestos adicionales no identificados pero sensibles al ozono que gobiernan el comportamiento de cortejo en esta especie. Curiosamente, ambas subespecies de D. mojavensis probadas, a diferencia de las otras especies, exhibieron una disminución del cortejo macho-macho después de la exposición al ozono. De nuevo, compuestos adicionales a los descritos para estas subespecies10,11 podrían explicar estos resultados. Finalmente probamos D. suzukii, una especie que no exhibe ningún compuesto específico del sexo y cuyo comportamiento se supone que es más bien visual11,25. Como era de esperar, ni el éxito de apareamiento ni el cortejo entre machos se vieron afectados por el tratamiento con ozono (Fig. 3).

a Los datos representan áreas máximas normalizadas de feromonas en moscas de control y expuestas al ozono (prueba t no pareada de dos colas; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). b, c Efecto sobre el éxito de apareamiento (es decir, porcentaje de experimentos que resultaron en apareamiento) y efecto sobre el comportamiento de cortejo macho-macho (es decir, porcentaje de experimentos que resultaron en cortejo macho-macho). Prueba exacta de Fisher de dos colas, *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se ha demostrado que los contaminantes como el ozono y los óxidos nítricos degradan los volátiles florales y, por lo tanto, corrompen la comunicación química entre las plantas y sus insectos polinizadores26,27,28,29,30,31,32. Aquí mostramos que el ozono además puede dañar a los insectos en otro contexto. La exposición de las moscas a niveles de ozono bastante leves que ya se han informado en áreas contaminadas degrada sus feromonas insaturadas y, por lo tanto, afecta la comunicación sexual en 9 de cada 10 especies de Drosophila analizadas. Sin embargo, los dobles enlaces de carbono no son específicos de las feromonas de Drosophila, pero son una característica principal de la mayoría de las feromonas de insectos identificadas33. Dado que, por ejemplo, muchas hembras de lepidópteros utilizan feromonas para atraer a los machos a largas distancias, hay tiempo suficiente para que los contaminantes oxidantes degraden potencialmente la señal antes de que llegue al receptor. Si bien hoy en día el efecto perjudicial de los pesticidas sobre las poblaciones de insectos está bien establecido en todo el mundo34,35, los insectos obviamente enfrentan un segundo problema: la degradación de sus canales de información química por el aumento de los niveles de contaminantes oxidantes.

Las moscas de tipo salvaje utilizadas en este estudio se obtuvieron del Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; https://bdsc.indiana.edu/index.html), National Drosophila Species Stock Center (NDSSC; http://blogs.cornell. edu/drosophila/) y el centro de valores de Kyoto (Kyoto DGGR; https://kyotofly.kit.jp/cgi-bin/stocks/index.cgi). Los números de inventario son los siguientes: D. putrida (15081–1401.00 / 15100–1711.01), D. repletoides (E-17001), D. funebris (15120–1911.05), D. pallidipennis (15210–2331.02), D. saltans (14028–0571.00 / 15250–2451.01), D. moj. wrigleyi (15081–1352.22), D. moj. mojavensis (15081–1352.47), D. busckii (1300–0081.00), D. suzukii (14029–0011.01 / 14011–0131.04). Para los experimentos con D. melanogaster usamos la cepa de tipo salvaje Canton-S (CS). Todas las moscas se criaron a 25 °C, 12 h de luz: 12 h de oscuridad y 70 % de humedad relativa. A excepción de D. melanogaster (CS), todas las demás especies de moscas se criaron con alimento estándar mezclado con banano. Las vírgenes se recogieron usando anestesia con CO2. Se probaron moscas vírgenes de 10 días de edad en la arena de cortejo. El cuidado y tratamiento de todas las moscas cumplió con todas las normas éticas pertinentes.

Sintetizamos compuestos de mosca que incluyen (Z)-10-Heptadecen-2-one (Z10-17:2Kt), (Z)-11-Hexadecen-1-yl acetato (Z11-16:Ac), rac-2-Tridecyl acetato (13:2Ac), acetato de rac-2-pentadecilo (15:2Ac), acetato de (Z)-11-eicosen-1-ilo (Z11-20:Ac), acetato de (Z)-10-heptadecen-2-ilo (Z10-17:2Ac) como se describe11. Otros productos químicos, incluidos el acetato de cis vanccenilo (cVA), (Z)-7-tricoseno (7-T), (Z)-9-tricoseno (9-T), (Z)-7-pentacoseno (7-P) y (Z)-9-pentacoseno (9-P), se adquirieron en alta pureza de Sigma-Aldrich y Cayman Chemical.

(Z)-11-pentacoseno (11-P) se sintetizó mediante la reacción de Wittig a partir de bromotetradecano (Sigma-Adrich, Alemania) y undecanal (Sigma-Aldrich, Alemania). Se disolvieron bromotetradecano (1 g, 3,6 mmol) y trifenilfosfina (946 mg, 3,6 mmol) en 20 ml de tolueno y se calentaron a reflujo durante 20 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la fase de tolueno se eliminó cuidadosamente con una pipeta. El residuo se agitó durante 5 min con tolueno fresco (10 ml cada uno), antes de que el tolueno se pipeteara de nuevo. Este proceso se repitió tres veces con tolueno y una vez con éter dietílico (10 ml). El residuo altamente viscoso se secó a alto vacío durante la noche para obtener la sal de Wittig como un sólido blanquecino amorfo.

Bajo argón, la sal de Wittig (600 mg, 1,11 mmol) se disolvió/suspendió en THF anhidro (20 ml) y se enfrió a -30 °C. Se añadió gota a gota una solución de bis(trimetilsilil)amida de sodio (1,2 ml, 1 M en THF) y se dejó calentar la mezcla hasta -10 °C. Después de agitar durante 30 minutos, la suspensión ahora de color naranja intenso se enfrió a -30 °C nuevamente antes de agregar undecanal (0,23 ml, 1,11 mmol) mediante una jeringa. La mezcla se agitó durante la noche a 20 °C. La mezcla de reacción se diluyó con n-hexano (20 ml) antes de agregar agua (40 ml). Se eliminó la fase orgánica y se extrajo la fase acuosa con n-hexano (2 x 40 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera (40 ml cada una) y se secaron sobre Mg2SO4. Después de la filtración, el solvente se eliminó mediante rotavapor, el residuo se adsorbió en gel de sílice y se cromatografió con n-hexano/EtOAc (50:1) como eluyente para obtener (Z)-11-pentacoseno (130 mg, 34 % de rendimiento basado en undecanal) como un aceite incoloro.

Sistema de exposición al ozono ver Fig. S1. Se utilizó aire ambiental comprimido (con 4,5 ± 0,5 ppb de ozono) para producir aire de control (es decir, aire ambiental humidificado al 70 % de humedad relativa), aire limpio (es decir, aire que mediante un depurador de ozono de paladio se limpió de todo el ozono natural) y aire enriquecido con ozono (es decir, aire ambiental que se conducía a través de un generador de ozono (Aqua Medic, Alemania) que podía producir hasta 100 mg de ozono/h). Al humedecer y mezclar aire limpio enriquecido con ozono en la caja de mezcla, se pueden producir diferentes niveles de aire experimental ozonizado. La concentración de ozono podría aumentarse (disminuirse) disminuyendo (aumentando) el caudal a través del controlador de caudal másico antes del depurador de ozono (p. ej., 5 l/min), mientras que el caudal a través del generador de ozono se mantuvo constante en 0,7 l/min . Como las concentraciones de ozono cambian cuando el aire se humedece, el aire experimental ozonizado se almacenó dinámicamente en una caja de mezcla (un recipiente de plexiglás de 100 l), desde el cual se sondeó continuamente el aire para el monitor de ozono (BMT 932, BMT Messtechnik GmbH, Alemania), mientras al mismo tiempo, cada 0,2 l/min se condujo a los cuatro viales de plástico de 70 ml que contenían las moscas, y el exceso de aire se limpió del ozono mediante un depurador de ozono de paladio adicional antes de liberarlo en el aire de la cámara. Se conectó un segundo conjunto de cuatro viales de 70 ml al flujo de aire del ambiente para producir "moscas de control" para el experimento. Todo el sistema se construyó dos veces con una válvula que cambiaba el aire enriquecido con ozono entre las dos configuraciones para que se pudiera preparar otro conjunto de moscas experimentales y de control en paralelo. Por ejemplo, abriendo la válvula 5 s hacia la izquierda y 10 s hacia la derecha, se pueden realizar experimentos con diferentes concentraciones de ozono en paralelo.

Para analizar los perfiles químicos de las moscas en los experimentos TDU GC-MS, las moscas de 10 días de edad se expusieron primero al ozono o al aire de control durante un tiempo determinado y luego se congelaron inmediatamente a -20 °C durante 30 min. Con el fin de investigar la recuperación de los perfiles químicos después de la exposición al ozono, los machos fueron expuestos a 100 ppb de ozono durante 2 h y luego se trasladaron a tubos con alimentos estándar durante 1 o 5 días. Posteriormente se congelaron como se mencionó anteriormente. Para las mediciones de TDU GC-MS, se colocaron moscas individuales en microviales de tubos de desorción térmica (GERSTEL, Alemania) y se agregaron 0,5 µl de C10-Br o C16-Br (dilución 10−3 en hexano) a los microviales como estándar interno.

Los tubos de desorción se transfirieron utilizando un muestreador multipropósito GERSTEL MPS 2 XL a una unidad de desorción térmica GERSTEL (GERSTEL, Alemania). Las muestras se desorbieron a 250 °C durante 8 min, luego se atraparon a -50 °C en el revestimiento de un sistema de inyección refrigerado GERSTEL CIS 4, con nitrógeno líquido utilizado para el enfriamiento. Los componentes se transfirieron a la columna de GC calentando el inyector del vaporizador de temperatura programable a 12 °C/s hasta 270 °C y luego manteniendo la temperatura durante 5 min. El GC-MS (Agilent GC 7890A equipado con una unidad MS 5975 C inert XL MSD; Agilent Technologies, EE. UU.) estaba equipado con una columna HP5 (Agilent Technologies, EE. UU.). La temperatura del horno de cromatografía de gases se mantuvo a 50 °C durante 3 min y luego se aumentó en 15 °C/min hasta 230 °C y luego en 20 °C/min hasta 280 °C, y se mantuvo durante 20 min. Los espectros de masas se tomaron en modo EI (a 70 eV) en el rango de 33 m/za 500 m/z.

Se recolectaron machos y hembras vírgenes de todos los drosófilos probados después de la eclosión y se criaron individualmente y en grupos (20 individuos/vial), respectivamente. Para los ensayos de cortejo macho-hembra, 15 machos fueron expuestos a ozono o aire ambiental en un vial. A continuación, se colocó un macho individual tratado con ozono con una hembra no tratada en una cámara de cortejo y se observó y cuantificó su comportamiento durante 1 hora. Cada arena de cortejo contenía 4 cámaras (1 cm de diámetro × 0,5 cm de profundidad) cubiertas con un portaobjetos de plástico. Se grabaron cuatro cámaras simultáneamente. Se añadió un flujo de aire de 0,2 ml/min desde abajo a cada arena. Se utilizó una GoPro Camera 4 o Logitech C615 para registrar los comportamientos de cortejo. Cada video se analizó manualmente para la latencia de cortejo (es decir, el tiempo hasta que el macho inició el comportamiento de cortejo), el porcentaje de cortejo (es decir, el porcentaje de machos que mostraron un comportamiento de cortejo), el índice de cortejo (es decir, el tiempo que cada macho realizó el comportamiento de cortejo durante el 10 min de tiempo experimental), latencia de apareamiento (es decir, el tiempo hasta que comenzó el apareamiento exitoso) y éxito de apareamiento (es decir, el porcentaje de machos que copularon). Todos los experimentos de comportamiento se realizaron a 25 °C y 70 % de humedad.

Para los ensayos de cortejo macho-macho, 25 machos fueron expuestos a ozono o aire ambiental en un tubo de mosca. Posteriormente, se colocaron dos machos en una cámara y se observaron y cuantificaron sus comportamientos durante 30 min. Para D. melanogaster (CS), se probaron varias combinaciones de exposición al ozono (es decir, 15 min, 30 min y 2 h con 50, 100, 150 y 200 ppb, respectivamente). Los machos de otros drosófilos se expusieron durante 2 h a 100 ppb. Para los ensayos sin elección con machos decapitados, los machos se expusieron a ozono y luego se decapitaron. Se colocaron un macho intacto y un macho decapitado en una cámara y se observó y cuantificó el comportamiento de cortejo del macho intacto durante 30 min. Para los ensayos de dos opciones con moscas decapitadas, los machos y/o las hembras se expusieron al ozono y luego se decapitaron. Un macho intacto y un macho y una hembra decapitados se pusieron en una cámara. El índice de preferencia del cortejo del macho intacto se calculó como (tiempo que tarda un macho intacto en cortejar a una hembra decapitada; el tiempo que tarda un macho intacto en cortejar a un macho decapitado)/30 min.

Las moscas macho D. melanogaster (CS) se expusieron a ozono o al aire ambiente y luego se inmovilizaron en una punta de pipeta. Se colocó un electrodo de referencia en el ojo; se insertó otro electrodo de tungsteno en el sensillum objetivo. El at1 fue identificado en base a su ubicación y actividades espontáneas. Las señales fueron amplificadas por Syntech Universal AC/DC Probe (Syntech, Alemania), muestreadas (96 000,0 muestras/s) y filtradas (500–5000 Hz con supresión de 50/60 Hz) a través de una conexión USB-IDAC (Syntech, Alemania) a un ordenador. Los potenciales de acción se extrajeron utilizando el software AutoSpike (Syntech, Alemania). Los compuestos sintéticos se diluyeron en aceite mineral (MO) (Sigma-Aldrich, Alemania). Antes de la prueba, 10 μl del olor diluido se cargaron recientemente en un pequeño trozo de papel de filtro (1 cm2) y se colocaron dentro de una pipeta Pasteur de vidrio. Las dosis de olor probadas oscilaron entre 10-5-10-1 dilución (v/v). El odorante se suministró insertando la punta de la pipeta en una corriente de aire humidificado constante que fluía a 600 ml/min a través de un tubo de acero inoxidable (diámetro, 8 mm) que terminaba a 1 cm de distancia de la antena. La actividad neuronal se registró durante 10 s, comenzando 3 s antes del período de estimulación de 0,5 s. Las respuestas de las neuronas individuales se calcularon como el aumento (o disminución) de la frecuencia del potencial de acción (picos/s) en relación con la frecuencia previa al estímulo. Las trazas se procesaron clasificando las amplitudes de los picos en AutoSpike, el análisis en Excel y la ilustración en Adobe Illustrator CS (Adobe Systems, EE. UU.).

Los análisis estadísticos (ver las leyendas correspondientes de cada figura) y las cifras preliminares se realizaron utilizando GraphPad Prism v. 8 (GraphPad Software, EE. UU.). Luego, las figuras se procesaron con Adobe Illustrator CS5.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados en este estudio se proporcionan en el archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a I. Alali y S. Trautheim por su ayuda con la cría de moscas. Esta investigación fue financiada con fondos de la Sociedad Max Planck y, específicamente, con fondos del Centro Max Planck "Ecología química de insectos de próxima generación".

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Estos autores contribuyeron igualmente: Bill S. Hansson, Markus Knaden.

Departamento de Neuroetología Evolutiva, Instituto Max Planck de Ecología Química, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Alemania

Nan-Ji Jiang, Hetan Chang, Kerstin Weniger, Bill S. Hansson y Markus Knaden

Ecología química de insectos de próxima generación, Centro Max Planck, Instituto Max Planck de ecología química, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Alemania

Nan-Ji Jiang, Bill S. Hansson y Markus Knaden

Grupo de Investigación de Espectrometría de Masas/Proteómica, Instituto Max Planck de Ecología Química, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Alemania

Jerrit Weissflog

Instituto Max Planck de Ecología Química, Hans-Knöll Straße 8, D-07745, Jena, Alemania

Franziska Eberl y Daniel Veit

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NJ.J., BSH y MK diseñaron el plan de investigación y NJ.J. realizó la mayoría de los experimentos. HC realizó experimentos SSR. FE y DV construyeron el dispositivo de exposición al ozono. NJ.J y KW analizaron y cuantificaron compuestos de feromonas. JW sintetizó compuestos sintéticos. NJ.J. datos experimentales analizados. NJ.J., BSH y MK escribieron el artículo. Todos los autores editaron el manuscrito.

Correspondencia a Markus Knaden.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Sylvia Anton y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Jiang, NJ., Chang, H., Weißflog, J. et al. La exposición al ozono interrumpe la comunicación sexual de los insectos. Nat Comun 14, 1186 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36534-9

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Recibido: 28 de octubre de 2022

Aceptado: 06 febrero 2023

Publicado: 14 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36534-9

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