Rendimiento y reproducibilidad de la hiperpolarización 13C y 15N utilizando un criógeno - Almacenamiento criogénico Co., Ltd de Chengdu

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 11694 (2022) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Se describe la configuración, los procedimientos operativos y el rendimiento de un dispositivo sin criógeno para producir agentes de contraste hiperpolarizados mediante polarización nuclear dinámica de disolución (dDNP) en un centro de imágenes preclínicas. La polarización se optimizó utilizando la señal de RMN mejorada con DNP de estado sólido para calibrar la posición de la muestra, la frecuencia de microondas y RMN y la potencia y el ángulo de giro. La polarización de una formulación estándar para producir ~ 4 ml, ácido 1-13C-pirúvico 60 mM en una solución acuosa se cuantificó en cinco experimentos a P(13C) = (38 ± 6) % (19 ± 1) s después de la disolución. La constante de tiempo monoexponencial de la acumulación de la polarización de estado sólido se cuantificó en (1032 ± 22) s. Logramos un ciclo de trabajo de 1,5 h que incluye la carga de la muestra, el control de la acumulación de polarización, la disolución y la preparación para la siguiente ejecución. Después de la inyección del agente de contraste in vivo, se observaron piruvato, piruvato hidratado, lactato y alanina, midiendo mapas de metabolitos. En base a esta secuencia de trabajo se obtuvo urea 15N hiperpolarizada (P(15N) = (5,6 ± 0,8) % (30 ± 3) s después de la disolución).

La resonancia magnética nuclear (RMN) ha revolucionado los diagnósticos modernos al proporcionar imágenes anatómicas y funcionales de alta resolución en 3D sin radiación ionizante1,2. Muchos de los procesos bioquímicos in vivo, sin embargo, aún escapan a nuestros mejores esfuerzos, y acceder a ellos sigue siendo un objetivo principal de muchas investigaciones.

Aquí, los agentes de contraste hiperpolarizados son muy prometedores, ya que proporcionan una ventana única al metabolismo, de forma no invasiva e in vivo. Al aumentar la señal de moléculas seleccionadas, a menudo endógenas, se puede seguir su destino, durante un tiempo limitado, con una alta resolución espacial y química. Estas propiedades han permitido la identificación de tejido canceroso antes de que se manifieste un tumor y han ayudado a controlar la respuesta al tratamiento.

Dissolution dynamic nuclear polarization (dDNP) 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 10158–10163 (2003)." href="/articles/s41598-022-15380-7#ref-CR3" id="ref-link-section-d50401522e516"> 3 es la técnica más establecida para biomoléculas hiperpolarizantes (HP) para imágenes in vivo, y comparte la aplicabilidad en humanos4,5 solo con xenón hiperpolarizado6. Otras técnicas HP incluyen fuerza bruta7, polarización inducida por parahidrógeno8, polarización nuclear dinámica inducida químicamente9 y, para gases nobles, bombeo óptico de intercambio de espín10,11.

El dDNP ha permitido polarizar biomoléculas a más del 50% en aproximadamente 1 h12,13. La polarización nuclear del objetivo se logra polarizando primero el espín electrónico, usando bajas temperaturas (≈ 1,4 K) y campos magnéticos altos (≈ 6,7 T). Luego, la polarización electrónica se transfiere a polarización nuclear utilizando las interacciones entre el espín electrónico y el nuclear bajo la acción de ondas electromagnéticas, transmitidas a una frecuencia correspondiente a la diferencia de frecuencia de Larmor de los dos espines electrónicos involucrados14. Los espines de electrones desapareados se agregan en forma de radicales estables: TEMPO15, TEMPOL o radicales tritilo16,17 o inducidos por radiación UV18. Además, existen otros tipos de formulaciones de muestra, por ejemplo, HYPOP19.

Cuando se logra el nivel deseado de polarización de espín nuclear, la muestra congelada se funde, disuelve y expulsa rápidamente del polarizador mediante agua sobrecalentada a presión, de modo que se obtiene un agente de contraste inyectable.

Overall, dDNP is a complex process combining nuclear magnetic resonance (NMR) electron spin resonance (ESR), radical chemistry, high magnetic fields, fast dissolution, and cryogenictemperatures. Making this process available for biomedical research routinely is not straight forward. Over the last decades, several experimental implementations of dDNP were presented such as a cryogen-consumption-free DNP 9.4 T polarizer20, a 129-GHz dynamic nuclear polarizer in an ultra-wide bore superconducting magnet21, a Dynamic Nuclear Polarization Polarizer for sterile Use Intent22 and a multisample 7 T dynamic nuclear polarization polarizer for preclinical hyperpolarized MR23. Moreover, a number of dDNP polarizer were commercialized: HyperSense by Oxford Instruments 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 10158–10163 (2003)." href="/articles/s41598-022-15380-7#ref-CR3" id="ref-link-section-d50401522e608">3, SpinLab de GE y SpinAligner de Polarize24.

Aquí presentamos nuestras primeras experiencias con la última incorporación a la familia, un polarizador de disolución sin criógeno para aplicaciones preclínicas (SpinAligner, Polarize, Dinamarca)24. Informamos sobre la instalación del dispositivo y la rutina para la hiperpolarización 13C y 15N. Al implementar procedimientos operativos de rutina, se logró una polarización alta y reproducible.

El polarizador utilizado en este trabajo (SpinAligner, Polarize, Dinamarca) es similar a una configuración descrita en 201924, pero presenta un imán diferente (6,7–10,4 T) y un módulo de disolución. Los componentes principales son un imán superconductor sin criógeno enfriado por un criostato de helio de ciclo cerrado, un inserto de temperatura variable (VTI), una fuente de microondas, un espectrómetro de RMN, un módulo de disolución y software de control (Figs. 1, 2) . El imán superconductor fue impulsado por una fuente de alimentación de 230 V/10 A para alcanzar un máximo. 9,4 T (en lugar de 10,4 T como se describe en 201924) y se usó a ~ 6,7 T aquí. Es relevante señalar que la ruta del fluido para la disolución está optimizada para aplicaciones preclínicas e in vitro.

Foto (a,b) y diagrama (c) del polarizador utilizado en este trabajo. El polarizador consta de un módulo de disolución (a) montado en el imán (sección b, cuadrado magenta) y un bastidor para piezas auxiliares. El módulo de disolución (a) contiene una entrada para el medio de disolución (DM), un calentador para DM (5), un colector Swagelok (1–4), una válvula de conmutación (6), el recipiente para muestras y una salida. El imán (sección b, cuadrado magenta) está equipado con un inserto de temperatura variable (VTI) que se enfría a 1,4 K evacuando un baño de helio líquido en la parte inferior del VTI. La presión del gas helio dentro del VTI y en la entrada se muestran en los monitores P1 (8) y P2 respectivamente. La sonda DNP dentro del VTI consta de un túnel para la copa de muestra, una guía de ondas para transmitir las microondas y una bobina NMR en la parte inferior. La muestra se inserta en el VTI a través de una esclusa de aire (7) en la parte superior. El rack se utiliza para albergar la bomba de circulación del helio del VTI, un espectrómetro de RMN, la fuente de alimentación magnética, los controladores de temperatura y la interfaz de usuario. La Figura c muestra una vista esquemática del polarizador nombrando todos los componentes principales.

Dibujos del sistema dDNP que indican la dimensión, el campo magnético perdido (líneas discontinuas) y el área del operador (línea roja). (Los dibujos se reproducen del Manual del usuario de SpinAligner con autorización).

Para la hiperpolarización, se llenaron aproximadamente 22 mg de una formulación que contenía el radical y el agente de contraste concentrado en una copa de muestra (PEEK, el volumen máximo de llenado es 400 µL), se sumergió en el imán y se polarizó. Una vez que se alcanzó la polarización deseada, la muestra se disolvió, expulsó y diluyó inyectando un medio de disolución sobrecalentado en la copa. La copa se conectó al sistema de fluidos del polarizador usando un sello anular desechable, se insertó en el VTI a través de una esclusa de aire (Fig. 1) y se bajó al imán usando un mecanismo controlado centralmente. En el VTI se alcanzaron temperaturas inferiores a 1,5 K bombeando sobre un baño de helio líquido. El helio se bombeó desde un cilindro de almacenamiento de 50 l al circuito cerrado de refrigeración para reponer el baño de helio después de la condensación en el refrigerador criogénico de imanes. Regresa al tanque a través de un filtro de carbón (dentro de la carcasa de los imanes). Se usó una válvula de aguja para controlar el suministro de helio al VTI, y los volúmenes se eligieron para que nunca excedan la presión atmosférica para garantizar la seguridad. Los monitores P1 y P2 muestran la presión de He en el interior. respectivamente, el VTI y justo fuera del tanque de He. La temperatura de la muestra se estimó mediante un termistor cerámico en el exterior de la cavidad de microondas de cobre y la presión dentro del VTI, medida debajo de la esclusa de aire.

Se conectó un espectrómetro de RMN (Cameleon, Spinit, RS2D) a una bobina Alderman-Grant dentro del VTI para adquirir la señal de RMN in situ. La frecuencia y la impedancia de la sonda de RMN se ajustaron utilizando condensadores variables de un circuito LC en una caja de aluminio fuera del orificio. Ajustar o cambiar el circuito permitió adquirir señales 1H, 13C, 15N, 63Cu o 129Xe.

Una fuente de microondas con una potencia de salida continua máxima de 100 mW proporcionó una irradiación constante o modulada en frecuencia25 de la muestra en el VTI según lo establecido por el software de control.

Todos los procedimientos fueron controlados por un software central y convertidores digital-analógico (Polarize; LabVIEW, National Instruments). En particular, los datos de más de 4 sensores se monitorearon constantemente y se almacenaron de forma comprimida.

El sistema dDNP se configuró cerca de una resonancia magnética de 7 T (diámetro de 30 cm, BioSpec 70/30, Bruker), dos espectrómetros de RMN de sobremesa de 1 T (Spinsolve Carbon and Nitrogen, Magritek) y un RMN de calibre ancho y alta resolución de 9,4 T. espectrómetro (diámetro de 9 cm, WB400, Avance NEO, sonda BBFO de 5 mm, Bruker). Una vez instalado, se realizó una serie de calibraciones (Tabla 2).

Toda la información sobre la muestra estándar se extrae del Manual del usuario de SpinAligner.

En la Tabla 1 se proporciona una descripción general, paso a paso, de la preparación del agente de contraste (CA): concentrados de radicales; el procedimiento específico para el piruvato se encuentra en la Tabla 4 y se puede adaptar para otras sustancias.

En general, cada vez se preparó una cantidad mayor (p. ej., 1,5 g) de concentrado de radicales CA, se dividió en alícuotas más pequeñas (p. ej., 250 mg) y se almacenó a -22 °C. Para un experimento de DNP, se calentó uno de estos lotes y se recuperó la cantidad deseada (por ejemplo, 22 mg).

Todos los experimentos se realizaron usando radical tritilo (AH111501, peso molecular 1595 g/mol, POLARIZAR) y uno de los agentes de contraste descritos a continuación.

Se preparó aproximadamente 1,5 ml de concentrado de radical de ácido pirúvico y se congeló en alícuotas de 250 µl a -24 °C, que contenían radical tritilo 30 mM y ácido 1-13C-pirúvico 14 M (Tabla 2 1-13CPA, peso molecular 89,05 g/mol, Sigma -Aldrich, CAS: 99124-30-8). Para cada experimento de dDNP, se calentó una alícuota y se recuperó la cantidad indicada del concentrado (típicamente 22 mg).

Se disolvieron 51 mg de radical tritilo y 250 mg de 13C,15N2-urea (peso molecular 60,05 g/mol, Sigma-Aldrich, CAS: 58069-83-3) en 500 mg de agua desionizada y 500 mg de glicerol (G7893-500 mL, PM 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5, Sigma-Aldrich). El concentrado resultante contenía 35,5 mM de radical tritilo y 4,62 M de urea y se almacenó a -24 °C. Para cada experimento de DNP, la cantidad indicada del concentrado (típicamente 54 mg) se tomó del stock y se transfirió a la copa de muestra.

Se disolvieron 51 mg de radical tritilo y 250 mg de [1,3-15N] urea (peso molecular 60,05 g/mol, Sigma-Aldrich, CAS: 2067-80-3) en 500 mg de agua desionizada y 500 mg de glicerol (G7893-500 ml, PM 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5, Sigma-Aldrich). El concentrado resultante contenía 35,5 mM de radical tritilo y 4,62 M de urea y se almacenó a -24 °C. Para cada experimento de DNP, la cantidad indicada del concentrado (típicamente 54 mg) se tomó del stock y se llenó en la copa de muestra.

El medio de disolución se preparó mezclando 1,51 g de cristales preestablecidos de Trizma (pH 7,6, peso molecular promedio 149,0 g/mol Sigma-Aldrich, T7943) para tamponar la muestra para obtener un pH final cercano a 7, 27 mg de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, SERVA, CAS: 9002-07-7), 0,756 g de NaCl (Sigma-Aldrich) y 0,81 g de NaOH (Sigma-Aldrich, CAS: 1310-73-2) en 250 mL de agua desionizada y almacenada a − 20 °C. Por lo general, se usaron 3,9 ml para un experimento. Para los experimentos con urea, solo se usó H2O con EDTA 0,27 mM.

Como se indica en el manual de SpinAligner, después de aumentar el imán, la intensidad del campo magnético se determinó detectando la señal de RMN de 63Cu de estado sólido de la bobina de RMN (B0 = 2π ν63Cu/γ63Cu) donde ν63Cu es la frecuencia de la resonancia de 63Cu y γ63Cu/2π = 11,319 MHz/T es su relación magnetogira. Con B0 se calcularon correspondientemente las frecuencias de 13C, 15N, 129Xe y e- (νx = B0 γx/2π) (ver otros valores de γx en SI). Se realizó una calibración más fina de las frecuencias utilizando la señal de RMN de los núcleos.

A continuación, NA es el número de promedios por espectro, NS es el número de escaneos por espectro, NX es el número de excitaciones dentro del período TR, TR es el tiempo de repetición y TX es el tiempo entre dos excitaciones consecutivas dentro de una serie de pulsos. . Cuando medimos los espectros de RMN con DNP (Spinit, RS2D), a menudo usamos NS = 1 o 4, con TX < TR; los parámetros comunes fueron TX = 217 µs y TR de 1 min a 1 h. Cuando medimos los espectros de RMN con espectrómetros de RMN, NS fue 1, por lo tanto, TX = TR.

El ángulo de giro de RF α se calibró mediante el uso de un tren de excitaciones de ángulo de giro bajo en una muestra mejorada con DNP. Se aplicaron 490 excitaciones en 10 s (TR = 1 s, TX = 217 µs, NX = 49, NS = 1) dando como resultado un promedio de excitaciones por segundo N = NX/TR = 49 s−1. Se registró y procesó cada 49 decaimiento por inducción libre (FID). Luego ajustamos una función de decaimiento monoexponencial a los datos.

(Elliott et al. ilustran una descripción extensa de este enfoque)26.

Usaremos la misma función para ajustar el decaimiento de la polarización en estado líquido para obtener \(T_{1}^{obs}\) aparente (explicado con más detalles a continuación).

Suponiendo que la polarización no se relajó significativamente durante el transcurso del experimento, nos permitió obtener el ángulo de giro aplicado (Ec. 2, detalles en SI):

donde S(t) es la señal adquirida en el punto de tiempo t, S0 es la señal inicial, \({\uptau }\) es la constante ajustada, NX es el número total de excitaciones por período TR, N es el número de excitaciones por segundo .

Asumiendo la linealidad del amplificador de potencia de RF, esta calibración se usó para establecer el ángulo de excitación para otras duraciones \(p_{d}^{RF}\) o atenuación de potencia \(p_{a}^{RF}\) (en dB) utilizando los ajustes para el ángulo calibrado:

La transferencia de polarización de los electrones a los núcleos se optimizó adquiriendo la señal 13C- o 15N-NMR mejorada con DNP en función de la potencia de microondas (en W) \(p_{w}^{{{\mathbf{\mu W}} }}\) (el incremento común de \(p_{w}^{{{\mathbf{\mu W}}}}\) fue de 5 mW) y la frecuencia νµW (el incremento común de νµW fue de 10 MHz). Después de 1 a 2 minutos de irradiación con microondas, se midió la señal de RMN de 13C (o 15N) de estado sólido del concentrado de radicales CA polarizados con DNP usando un pulso de excitación constante de 2° a 5° para diferentes configuraciones de la frecuencia o potencia µW. Se aplicaron mil pulsos con el mismo ángulo de giro después de cada adquisición para saturar la polarización restante.

Se polarizó un concentrado de radicales de piruvato durante 40 min y se movió a diferentes posiciones en el VTI, donde se adquirieron ~ 2 ° espectros de 13C.

Para detectar la señal de RMN de 13C en estado sólido en equilibrio térmico en el polarizador, se prepararon 247,9 mg de concentrado de radical piruvato (radical de tritilo 30 mM y 1-13C-PA 14 M) y se insertaron en la sonda a ≈ 1,4 K. Cada hora , se adquirieron varios espectros de RMN de 13C de ángulo de giro bajo para monitorear la magnetización que alcanza el equilibrio (\(\alpha\) ~ 0.32°, \(p_{d}^{RF}\) = 2 us, \(p_{a }^{RF}\) = 38 dB, NS = 256, TS = 217 us y TR = 1 h). Los datos se exportaron y procesaron fuera de línea (línea de base, corrección de fase, relleno cero a 4096 e integración, MestReNova). Se ajustó una función de recuperación monoexponencial (ecuación 4) a los datos para obtener la señal de equilibrio aparente \(S_{inf}^{\alpha }\) y el tiempo de recuperación aparente de estado sólido \(T_{1}^ {observaciones}\):

Conociendo el ángulo de excitación \(\alpha\) y el número de excitaciones por segundo \(N\), estimamos el tiempo real de relajación y la señal de equilibrio (ver SI para más detalles) como

\(S_{inf}\) es la señal de equilibrio cuando se alcanza el equilibrio completo de la señal sin excitaciones de RF y como antes \(N = NX/TR\) (Ec. 2).

La acumulación de la polarización de estado sólido mejorada con DNP se controló in situ usando excitación \(\alpha \cong 0.7^\circ\) con NS = 4 para 13C-DNP y alrededor de 3,5° para NS = 1 para 15N -DNP. Las señales S(t) se integraron automáticamente y se visualizaron en el polarizador junto con una función de recuperación exponencial ajustada a los datos. Para un análisis más detallado, los espectros se procesaron fuera de línea (relleno de cero, corrección de línea base, corrección de fase, integración; MestReNova). Se ajustó una función de recuperación monoexponencial (Ec. 5) a los datos para obtener la constante de acumulación TDNP, teniendo en cuenta el efecto del ángulo de giro (Ec. 6).

La mejora de la señal DNP ε de la muestra sólida en el polarizador se calculó utilizando las intensidades de señal de los espectros térmico e hiperpolarizado, teniendo en cuenta los parámetros de adquisición (Ec. 8).

donde S son las integrales sobre las señales de RMN correspondientes, \(NS_{{{\text{acq}}}}^{TP}\) y \(NS_{{{\text{acq}}}}^{HP}\ ) son el número de escaneos para la muestra térmica e hiperpolarizada, y \(\alpha_{HP}\) y \(\alpha_{TP}\) son los ángulos de giro de excitación utilizados para adquirir los espectros hiperpolarizados y térmicos, respectivamente. \(RG_{TP}\) y \(RG_{HP}\) son valores de ganancias lineales del receptor (observar que T1 por lo tanto S valores de corrección se muestran en SI).

La polarización absoluta se calculó multiplicando la mejora por la polarización térmica (\(P^{{{\text{TP}}}}\), Ec. (9)): PTP(13C) (1 T, 295 K) = 0,8711 ppm, PTP(13C) (6,65 T, 1,4 K) = 1220 ppm, PTP(13C) (9,4 T, 295 K) = 8,187 ppm, (15N)PTP(15N) (9,4 T, 295 K) = 3,3 ppm.

donde \(\hbar\) es la constante de Planck reducida, ε es el factor de mejora, kB es la constante de Boltzmann, B0 es el campo magnético y T es la temperatura.

La RMN de estado líquido se adquirió mediante una RMN de sobremesa de 1 T (Spinsolve Carbon, Magritek) o una RMN de alta resolución de 9,4 T (WB400, Avance NEO, sonda BBFO de 5 mm, Bruker). Las intensidades de la señal de 13C o 15N se cuantificaron utilizando la línea de base automática y la corrección de fase manual antes de la integración numérica (la región de integración alrededor de la señal fue de ± 1 ppm a 9,4 T y ± 2 ppm a 1 T, utilizando TopSpin o MestReNova).

Para acelerar la adquisición de RMN de 13C de muestras polarizadas térmicamente a 1 T, se añadió agente de contraste de Gd al 4% en volumen ([Gd], 1 mmol/ml, Gadovist, Bayer). Usamos 3600 promedios, ángulo de giro de 20 °, TR = 2 s y RG = 31 (tenga en cuenta que se usó el mismo RG para adquirir espectros de RMN en estado líquido de la solución hiperpolarizada). El T1 estimado fue de 50 ms.

Para obtener una señal de 13C térmicamente polarizada a 9,4 T, utilizamos un solo escaneo con un ángulo de giro de 90°, con RG = 101, 20 min después de la disolución (RG = 0,25 para los espectros de RMN en estado líquido de la solución hiperpolarizada).

Para 15N NMR, se añadió 3% en volumen de [Gd] y se recogieron 128 adquisiciones después de un ángulo de giro de 90° a 9,4 T usando TR = 17 s. No se observó señal térmica de 15N a 1 T en 100.000 promedios y TR = 2 s.

Los espectros hiperpolarizados se adquirieron después de la transferencia manual al dispositivo respectivo secuencialmente utilizando un tiempo de repetición fijo TR y un ángulo de giro constante \(\alpha_{HP}\).

Para cuantificar el tiempo de vida de la hiperpolarización \(T_{1}^{HP}\), se ajustó una función de decaimiento monoexponencial a los datos que arrojaron \(T_{1}^{obs}\) (Ec. 1). \(T_{1}^{obs}\) se corrigió considerando la polarización consumida por las excitaciones de RF repetitivas utilizando la ecuación. (6) (Ec. 6, ver detalles en SI).

La potenciación de la señal \(\varepsilon\) y la polarización absoluta P se cuantificaron con respecto a la señal (promediada) de las muestras térmicamente polarizadas usando (Ecs. 5 y 7).

Tenga en cuenta que todos los experimentos que se muestran aquí se analizaron sin sustracciones de fondo.

Dos machos FVB.TgN(Ela1KRAS.G12D)9EPS.CEABAC fueron criados en el Establecimiento Animal Central del Hospital Universitario Schleswig–Holstein, Kiel, Alemania. Los animales se midieron a los ~ 9 meses y tenían un peso de ~ 35 g. Este estudio se realizó de conformidad con la Ley alemana de protección animal. El comité de protección animal de las autoridades locales (Ministerio de Energía, Agricultura, Medio Ambiente, Naturaleza y Digitalización Schleswig–Holstein (MELUND)) aprobó todos los experimentos (V242-18779/2021(2-1/21)).

Este estudio se informa de acuerdo con las pautas ARRIVE.

Se anestesió un modelo de ratón para tumor pancreático espontáneo usando una inyección intraperitoneal de 75 mg/kg de ketamina y 0,5 mg/kg de medetomidina. La anestesia se diluyó 1:5 con NaCl al 0,9 %, lo que produjo 155 µl de solución por ratón. Se usó un catéter en la vena de la cola para inyectar 200 µL de solución HP 1-13C-PA. Durante las mediciones in vivo, los animales se calentaron a través de la cama y los parámetros vitales de los animales se monitorearon continuamente. Después de las mediciones de resonancia magnética (~ 1 h), los animales fueron sacrificados sin despertar por dislocación cervical. Las imágenes se adquirieron en un sistema de resonancia magnética de 30 cm y 7 T (Biospec 70/30, Avance Neo, Bruker, Alemania), equipado con una bobina de transmisión de volumen cilíndrica de doble sintonización 1H-/13C (72 mm de diámetro y 100 mm de longitud). y bobina receptora de superficie 13C flexible (20 mm de diámetro, RAPID biomed, Alemania)).

Se adquirió una resonancia magnética RARE 1H 2D ponderada en T2 como referencia anatómica (tiempo de adquisición = 76,5 s, TR = 0,75 s, TE = 13 ms, tamaño de matriz de 256 × 256 y campo de visión FOV = 33 mm × 33 mm, 9 cortes con espesor de corte = 4,26 mm, ángulo de giro 90°/180°).

La imagen de desplazamiento químico (CSI) 2D de decaimiento por inducción libre se adquirió cada 5 s durante ocho veces seguidas (tiempo de adquisición = 5 s, TR = 44,62 ms, TE = 0,489 ms, tamaño de matriz de 11 × 11, FOV = 33 mm × 33 mm, corte único, grosor del corte = 4,26 mm, ángulo de giro 5°)27,28,29.

Las imágenes 13C-CSI se procesaron utilizando un script desarrollado por el grupo de Franz Schilling (Matlab).

El polarizador es móvil, montado sobre ruedas (fig. 1) y se colocó a una distancia de 3 m de la RM preclínica de 7 T, a 2 m de dos espectrómetros de RMN de sobremesa de 1 T ya 5 m de la RMN de 9,4 T. La configuración se proporcionó con una toma de corriente monofásica (10 A), aire seco y presurizado (compresor de aire tipo Atlas Copco 8F1) y gas Helio de una botella de 50 L (pureza 5.0, Air Liquide). El compresor de helio para enfriar el imán se instaló a una distancia de 9 m utilizando una línea de helio de 20 m. El compresor de He requiere agua de enfriamiento y energía eléctrica trifásica (F-70H, Sumitomo).

El imán se evacuó (bomba de vacío HiCube 80 Classic, Pfeiffer Vacuum) antes de encender el enfriador de He de ciclo cerrado (presión recomendada < 1 × 10−4 mbar). Cuando se alcanzó una temperatura de 1,5 K (calculada a partir de la presión de la salida VTI), el campo objetivo de 6,7 T se estableció en la interfaz de usuario del polarizador y el imán aumentó en ~ 30 min a I = 72,811 A (usando una calibración de fábrica). El período de estabilización tomó alrededor de 20 min.

La señal de RMN de 63Cu de la bobina de RMN en el VTI se detectó en ν63Cu = 75,259 MHz utilizando 4 promedios y un ángulo de giro de 32° (\(p_{a}^{RF}\) = − 2 dB, \(p_{ d}^{RF}\) = 2 µs, véase SI, Secc. 4.1.), lo que da como resultado B0 = 6,6489 T, frecuencia de 13C ν13C = 71,197 MHz y frecuencia de Larmor de electrones νe− = 186,397 GHz. El ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de la señal de 63Cu fue de 0,25 MHz (el procedimiento de calibración completo se describe en el manual de SpinAligner).

Para una calibración más fina de la frecuencia de resonancia del carbono, ~ 22 mg del concentrado de radical piruvato (30 mM de radical tritilo y 14 M de 1-13C-PA) se llenaron en la copa de muestra y se bajaron a 10 mm por encima del fondo del Investigacion. Después de ajustar el circuito LC, se inició DNP usando irradiación de microondas de onda continua (\(p_{a}^{MW}\) = 16 mW y νµW = 187,135 GHz), y se detectó una señal de RMN de 13C de estado sólido a ν13C = 71,492 MHz (4 promedios, los mismos parámetros de RF), lo que da como resultado un B0 = 6,6765 T y νe− = 187,17 GHz. 13C-FWHM fue de 0,16 MHz.

El área sensible de la bobina de RMN se determinó adquiriendo la señal de 13C mejorada con DNP en estado sólido en función de la posición de la muestra (Fig. 3a). Se encontró un máximo amplio alrededor de xs = 14 mm medido desde la posición más baja (parte inferior de la sonda). Para asegurar una temperatura de muestra baja, elegimos xS = 10 mm para todos los experimentos siguientes (dentro del 90 % de la señal máxima).

Calibración de la posición de la muestra y el ángulo de volteo. (a) Señal de piruvato de 13C-NMR de estado sólido mejorada con DNP en función de la posición de la muestra en la sonda. Para asegurar una señal suficiente, la muestra se polarizó primero durante 40 min. Luego, la señal de 13C se adquirió en diferentes posiciones xs cada minuto usando un ángulo de giro bajo de 2°. Moviendo la muestra primero hacia abajo, luego hacia arriba, se encontró un amplio máximo alrededor de xs = 14 mm. Se trazaron líneas rectas para guiar el ojo. (b) Señal de RMN de 13C mejorada con DNP adquirida por un tren de \(p_{d}^{RF}\) = 2 us, \(p_{a}^{RF}\) = pulsos de 18 dB con TX = 217 µs, TR = 1 s, NS = 1, NX = 49. Al ajustar una función monoexponencial a los datos (línea roja, \(\tau =\) 13,3 s, Ec. 1), se determinó el ángulo de giro para α = 3,2° (Ec. 2).

Para calibrar el ángulo de giro de 13C, se polarizó una muestra estándar mediante DNP y se adquirió un tren de decaimiento por inducción libre (FID) de ángulo bajo después de apagar las microondas (\(p_{d}^{RF}\) = 2 us , \(p_{a}^{RF}\) = 18 dB, TX = 217 µs, TR = 1 s, NS = 1, NX = 49 lo que lleva a N = 49 s−1 Fig. 3b). Al ajustar la Ec. (1) a la señal, la constante de decaimiento de la señal \(\tau =\) 13.3 s y α = 3.2° se obtuvo usando la ecuación. (2). Para muchos de los siguientes experimentos, se utilizó un ángulo de giro de ~ 0,32° (\(p_{d}^{RF}\) = 2 us, \(p_{a}^{RF}\) = 38 dB).

Para optimizar DNP, la transferencia de polarización de electrones a núcleos, la señal de 13C-NMR de estado sólido mejorada con DNP del concentrado de radical piruvato se adquirió usando TR = 2 min en función de la frecuencia µW (Fig. 4a, pasos de 10 MHz , \(p_{a}^{RF} =\) 3 dB, NS = 4, con α = 18°) y potencia fija \(p_{w}^{{{\mathbf{\mu W}}}} \) = 30 mW. Se encontraron dos extremos. Se eligió el máximo a 187,135 GHz para los siguientes experimentos de dDNP. Después de cada adquisición, la polarización se saturó con un tren de 1000 pulsos con un ángulo de excitación de 18°.

Para calibrar la potencia µW, repetimos el experimento, manteniendo constante la frecuencia y variando la potencia (Figs. 4b, incrementos de 5 mW). Se encontró que la señal de 13C aumentaba abruptamente entre ≈ 5 y 15 mW, formando una meseta que disminuía lentamente y que disminuía para potencias superiores a ≈ 40 mW. Para evitar el calentamiento de la muestra por irradiación de µW, manteniendo una alta polarización, elegimos una potencia de 16 mW para los siguientes experimentos de dDNP.

Optimización de la transferencia de polarización 13C. Señal de RMN-13C de estado sólido mejorada con DNP de piruvato a ≈ 1,4 K en función de la frecuencia de microondas (a, \(p_{w}^{MW}\) = 30 mW) y la potencia de microondas (b, νMF ≈ 187,135 GHz). Cuando se varió la frecuencia (a), se observaron dos extremos, y se eligió el primer máximo en ≈ 187.135 GHz para experimentos posteriores. Para el barrido de potencia, se encontró que la señal aumentaba hasta 20 mW; Se utilizaron 16 mW en los experimentos posteriores. Se agregaron líneas rectas para guiar el ojo. La polarización de 13C se destruyó después de cada adquisición de señal. Cada punto de datos corresponde a las señales de 13C adquiridas después de 2 min de DNP. Los parámetros de adquisición de RMN fueron \(p_{w}^{RF} =\) 2 µs, \(p_{a}^{RF} =\) 3 dB, NS = 4 y α ≈ 18°.

Cuantificación de la polarización en estado sólido. Señales de 13C-NMR de estado sólido de ácido pirúvico 1-13C 14 M mezclado con radical 30 mM (112,3 mg de peso total de la muestra) monitoreadas con excitaciones de ángulo de giro bajo (\(\alpha\) ~ 0,32°, NS = NX = 256 , TR = 1 h (a) o TR = 5 min (b)) alcanzando el equilibrio térmico a ≈ 1,4 K y 6,7 T (a) y durante DNP (b). Los cuadrados azules indican los espectros que se muestran a continuación (c, d). Ajustando una función de recuperación monoexponencial (Ec. 5) a la acumulación de polarización sin µW (a) y con µW (b) y corrigiendo las excitaciones de RF (Ec. 6), una relajación de estado sólido \(T_{ 1}^{ss} { } \approx { }\left( {5.45{ } \pm { }0.44} \right){\text{h }}\), señal en equilibrio térmico \({\text{señal} }S_{inf}^{ssTP } { } = { }\left( {4.07 \cdot 10^{4} \pm 0.1 \cdot 10^{4} } \right)\), tiempo de acumulación de DNP TDNP = (18.396 ± 0.49) min y señal de equilibrio \(S_{inf}^{ssDNP}\) = (\(2.0 \cdot 10^{7}\) ± \(0.2 \cdot 10^{6}\)) au (tenga en cuenta que esta acumulación es más rápida que para la muestra estándar). La polarización del espectro adquirida después de 110 min DNP se cuantificó a \(P^{obs,ssDNP}\) (110 min) = \(S_{ }^{ssDNP}\)(110 min) \(P^{{ {\text{TP}}}}\)/\(S_{inf}^{ssTP }\) ≈ 64%. Sin excitaciones de RF, se estima que la señal de estado estable esperada es \(P_{inf}^{ssDNP}\) = \(S_{inf}^{ssDNP}\) \(P^{{{\text{TP}} }}\)/\(S_{inf}^{ssTP }\) ≈ 61% Los espectros (c) y (d) son los últimos espectros medidos de recuperación térmica y DNP (marcados en (a) y (b) con azul rectángulos). Los primeros seis puntos de datos en (a) se ignoraron para el ajuste debido a una SNR muy baja.

El concentrado de radicales de ácido pirúvico se llenó en la copa y se bajó a xs = 10 mm por encima del fondo del VTI a ≈ 1,4 K. Mientras la muestra se acercaba al equilibrio térmico en B0 ≈ 6,7 T y T ≈ 1,4 K, 13C térmico la señal se monitorizó durante 24 h (fig. 1). Se observó un aumento de la señal asintótica y una función de recuperación monoexponencial (ecuación 6) ajustada a los datos arrojó un tiempo de relajación de estado sólido aparente \(T_{1}^{obs,ss}\) = (4,98 ± 0,40 ) h y señal térmica de estado estacionario aparente \(S_{inf}^{obs,ssTP}\) = 3,9 × 104 (R2 = 0,969). Utilizando los parámetros de adquisición de RMN (\(\alpha\) ~ 0,32°, NS = NX = 256 y TR = 1 h) y las ecuaciones. (3) y (6), el tiempo de vida corregido para la excitación se estimó en \(T_{1}^{ss}\) ≈ (5.45 ± 0.44) h (Ec. 6, N = 256/3600 s −1) y señal térmicamente polarizada \(S_{inf}^{ssTP }\) = 4.07 × 104 (R2 = 0.97) (Ec. 7). Al final se saturó la polarización térmica con un tren de 1000 pulsos con ángulo de giro de 5°.

A continuación, se inició DNP encendiendo la fuente de microondas en modo de onda continua utilizando los ajustes optimizados descritos anteriormente. La acumulación de la señal SDNP(t) de 13C mejorada con DNP se controló mediante la adquisición de un espectro de RMN cada minuto (Fig. 1, los mismos parámetros que antes pero con TR = 1 min). El último espectro, adquirido tDNP = 110 min desde el comienzo de DNP, arrojó una polarización de estado sólido de Pobs,ssDNP = 64%. Se ajustó una función de recuperación monoexponencial a los datos, lo que arrojó una constante de tiempo aparente de Tobs,DNP = (18,39 ± 0,50) min. Las excitaciones de RF casi no afectaron la acumulación de la señal DNP: TDNP = (18,396 ± 0,49) min, que corresponde a una polarización de ≈ 61%.

Se polarizó una muestra estándar como se describe anteriormente con una muestra de 22 mg. Una vez que se alcanzó la polarización deseada, se llenó una cámara de calentamiento con el medio de disolución (específico para el trazador y el tamaño de la muestra) (Fig. 1a-1). La solución se calentó hasta alcanzar una presión de 11 bar, correspondiente a la temperatura T ≈ 115 ºC. Justo antes de inyectar el medio en la copa de muestra, la copa se levantó 8 cm para reducir el impacto de la solución caliente en el baño de helio en el VTI. La inyección del medio de disolución en la copa de muestra se inició a través del software del polarizador. Dentro de ca. 2 s, la muestra se disolvió y se transfirió al recipiente receptor a través de un conjunto de tubería de doble pared (inyección a través del tubo interior, eyección a través del tubo exterior). Como se trataba de líquidos calientes y presurizados, se tuvo cuidado y se aplicaron medidas de seguridad.

Para cuantificar la polarización en estado líquido, la muestra se dividió entre tubos de RMN de 5 mm y se transfirió manualmente a espectrómetros de RMN de 1 T y 9,4 T, donde se adquirieron las señales hiperpolarizadas y (posteriormente) térmicamente polarizadas (Fig. 6). En este ejemplo, la polarización se cuantificó al 26 % a 1 T, 26 s después de la disolución, y al 20 % a 9,4 T, 30 s después de la disolución. La vida útil de la polarización se midió en 67 s para 1 T y 48 s para 9,4 T. Usando el T1 más largo que también corresponde al campo inferior, estimamos que la polarización en el momento de la disolución era del 38 % para la muestra medida en 1 T, y ≈ 31% para la muestra de 9,4 T. Tenga en cuenta que la muestra estuvo expuesta a campos magnéticos diferentes, variados y mucho más bajos durante la transferencia, por lo que usar el campo alto T1 para estimar la polarización solo proporciona una estimación muy aproximada.

Espectros de 13C-NMR de alta resolución de 1-13C-PA hiperpolarizado (negro) térmicamente polarizado (azul) medido a 1 T (a) y 9,4 T (b). (a) La señal hiperpolarizada se midió en un solo escaneo (NSDNP = 1) después de aprox. 26 s después de la disolución (\(\alpha\) = 5°, pw = 3,05 µs, pa = − 5,6 dB, SDNP = 32,38 au). La señal polarizada térmicamente se adquirió agregando un 4% en volumen de agente de contraste Gd (\(\alpha\) = 20°, pw = 12,20 µs, pa = − 5,6 dB, SDNP = 4,18 × 10−4 au). La mejora de la señal resultante para SDNP fue de 1,09 × 109 (Ec. 8), y la polarización = 26% (Ecs. 9, 10). (b) A 9,4 T, la señal se adquirió ≈ 30 s después de la disolución utilizando un pulso de 5° (SDNP = 7,59 × 105 au, pw = 10 µs, pa = − 18,9 dB, RG = 0,25) y se cuantificó con respecto a la señal polarizada térmicamente adquirida con un solo pulso de 90° (STP = 1,41 × 105 au, pw = 0,55 µs, pa = − 18,9 dB, RG = 101) a una mejora de 2,5 × 104 (ecuación 8) y polarización del 20 % (Ecuaciones 9, 10). Tenga en cuenta que debido a las diferencias en el RG, ambos espectros hiperpolarizados se normalizaron a 1 y el espectro térmico medido a 1 T se multiplicó por 5000 para encajar en la escala.

Al realizar más de 100 experimentos de DNP, el siguiente procedimiento demostró ser fundamental para obtener una polarización reproducible para el 1-13C-piruvato. Además de las calibraciones iniciales durante la configuración (Tabla 2), desarrollamos un procedimiento más elaborado que contiene calibraciones de rutina (Tabla 3), preparación específica de la química (Tabla 4), un procedimiento de polarización de 21 pasos (Tabla 5) y un rutina de mantenimiento semanal (Tabla 6). Estos procedimientos se desarrollaron para la polarización del piruvato, pero pueden servir como punto de partida para otros agentes (p. ej., a continuación para la urea 15N), aunque serán necesarias algunas modificaciones.

Usando estos procedimientos, evaluamos la reproducibilidad y el rendimiento para obtener ≈ 4 mL de solución con ácido pirúvico hiperpolarizado 60 mM, una composición adecuada para experimentos con animales30,31,32. El proceso de dDNP se repitió cinco veces en días diferentes utilizando muestras estándar de (21,64 ± 0,15) mg y 3,9 mL de medio de disolución y detección a 1 T (Tabla 7). En promedio, obtuvimos una constante de acumulación TDNP = (1032 ± 21,7) sy una polarización de estado sólido de (42,1 ± 3,7) au. Dependiendo del tiempo de transferencia ttrans (17–20 s), la polarización en estado líquido se cuantificó con respecto a la muestra polarizada térmicamente a P ≈ 33%–46%, con una media de (38 ± 5,7) %. Para estimar la polarización justo después de la disolución, usamos el T1 de las muestras y obtuvimos una polarización promedio de (47.2 ± 7.8) %33. Se midió que el valor de pH de la muestra dentro del tubo de RMN era de 8,51 ± 0,02.

Además de los experimentos de reproducibilidad, para evaluar cuántas muestras se pueden polarizar en un tiempo determinado, realizamos siete experimentos más de 1-13C-PA DNP cada ≈ 90 min utilizando el procedimiento descrito anteriormente: se necesitaron aproximadamente 30 min para preparar y limpiar el sistema, y ca. 60 min para dDNP. En promedio, se logró la polarización del estado líquido medida P(ttrans ≈26 s) = (33 ± 3,3) % que corresponde al valor estimado justo después de la disolución P(ttrans = 0) = (53,9 ± 12,4) %.

Para demostrar la viabilidad de la obtención de imágenes metabólicas in vivo, polarizamos 1-13C-PA con el procedimiento descrito anteriormente a P(ttrans = 0) ≈ 50 %.

Durante la acumulación de la polarización, se anestesió un ratón CEBAC, se equipó con un catéter en la vena de la cola y se colocó en la cama calentada para animales del sistema de resonancia magnética de 7 T. Se ajustó la bobina de resonancia magnética y se adquirieron imágenes anatómicas antes de la disolución (Fig. 7). No se apreció tumor en la resonancia magnética convencional.

Espectros de 13C-NMR de alta resolución de 1-13C-PA hiperpolarizado (negro) térmicamente polarizado (azul) (muestra 5 en la tabla) medido a 1 T. La señal hiperpolarizada se midió en un solo escaneo (NSDNP = 1) después de aprox. 17 s después de la disolución (\(\alpha\) = 5°, pw = 3,05 µs, pa = − 5,6 dB). La señal polarizada térmicamente se adquirió añadiendo 4% en volumen de agente de contraste Gd (\(\alpha\) = 20°, pw = 12,20 µs, pa = −5,6 dB, SDNP = 39,5 au). La mejora de la señal resultante para SDNP fue de 310 × 106 (Ec. 8), y la polarización = 43% (Ecs. 9, 10). El espectro térmico medido se multiplicó por 50.000 para encajar en la escala.

Después de la disolución con 5 ml de medio, el agente de contraste que contiene aprox. Se transfirió rápidamente 1-13C-PA 46 mM a la resonancia magnética y se inyectaron ≈ 100 ul en el catéter de la vena de la cola del ratón dentro de los 40 s después de la disolución. Aproximadamente 10 s después del final de la inyección, se realizó 13C-CSI a través de un corte axial abdominal. Se observaron señales de piruvato, lactato y alanina, y se prepararon mapas de cada metabolito (Fig. 8). Utilizando la misma geometría, se midió 1H T1w MRI. Observamos fuertes señales de lactato y piruvato en el hígado y el riñón. Se observó una SNR alta en vóxeles individuales y en ROI más grandes.

In vivo T1w 1H-MRI, mapas de 1-13C-PA hiperpolarizado y 1-13C-lactato (LA) y espectros de 13C seleccionados de un modelo de rata con tumor pancreático adquirido a 7 T. Después de la inyección de 100 µl de agente de contraste hiperpolarizado que contiene ~ 46 mM 1-13C-PA, se adquirieron ocho conjuntos de datos CSI. Se encontró una señal prominente de lactato en las regiones de riñón (ROI1), hígado (ROI2), aorta y rama de la vena cava inferior (ROI3). Se observó una fuerte SNR en el vóxel seleccionado (rectángulo azul), exhibiendo resonancias de lactato, piruvato y alanina (Ala) con un ancho de línea de aprox. 84 Hz. La bobina de bucle de solo recepción se colocó ventral (rectángulo amarillo) y se colocó un pequeño recipiente lleno de agua en el medio de la bobina (rectángulo verde, fantasma: Pha). Tenga en cuenta que los tubos que suministran agua tibia a la cama del animal aparecieron en la parte superior debido al alias. Se muestra la suma de ocho adquisiciones consecuentes.

El cambio de la caja LC nos permitió establecer la frecuencia de resonancia de la bobina de RMN en el polarizador a ≈ 28,83 MHz, la frecuencia de resonancia de 15N a 6,7 T. Esto nos permitió calibrar el ángulo de giro de 15N, la frecuencia de µW y la potencia usando un 200 mg muestra de 13C,15N2-urea 4,16 mM y radical 35,7 mM (α = 3,5° a pw = 3 us, pa = 10 dB, ν(µW) = 187,18 GHz, p(µW) = 35 mW). La señal de 15N-NMR de estado sólido mejorada con DNP se observó fácilmente y se obtuvo una constante de acumulación TDNP = (2140 ± 391) s para 13C,15N2-urea y (3358 ± 425) s para 15N2 urea.

La disolución se realizó utilizando 5 ml de H2O desionizada y EDTA 0,27 mM, lo que llevó a una concentración nominal de urea de 45,4 mM después de la disolución. Después de la transferencia al espectrómetro de RMN de 9,4 T, se adquirieron sesenta espectros de 15N de 5° (TR = 3 s) y se usaron para calcular T1 y cuantificar la polarización. El tiempo de vida de la muestra hiperpolarizada se determinó en T1(13C-15N urea) = (26,3 ± 1,0) sy T1(15N-urea) = (26,1 ± 0,7) s.

Para la urea 13C-15N2, se observó una polarización 15N de (4,5 ± 0,7) % ttrans = (30 ± 1) s después de la disolución (n = 4) y para la urea 15N2, la polarización se determinó en (5,6 ± 0,8) % después de (30 ± 3) s (n = 4), ambos con respecto a la señal de 15N de cada muestra en equilibrio térmico (TR = 17 s, 128 promedios, RG 101, α = 90°). La polarización inicial de 15N en el momento de la disolución (ttrans = 0 s) se estimó en P(15N) (t = 0 s) = (14,7 ± 1,7) % para urea 13C-15N2 y P(15N) (t = 0 s) = (18,4 ± 1,1)% para urea 15N234.

En este artículo, describimos nuestra experiencia inicial, las rutinas operativas y el rendimiento de un polarizador dDNP sin criógeno operado a 6,7 T.

El polarizador requiere una superficie de ≈ 2–3 m2, energía eléctrica monofásica estándar, aire comprimido y helio. El imán no está protegido activamente, por lo que se debe tener en cuenta la seguridad y se debe mantener cierta distancia de otros dispositivos. El compresor de helio requiere energía trifásica y agua de enfriamiento; requisitos previos que probablemente cumplan muchas instalaciones de RMN o MRI. El ruido de la bomba de helio en el polarizador y el crioexpansor puede ser un inconveniente para quienes trabajan cerca durante un tiempo prolongado.

Los principales peligros de la configuración incluyen fluidos a presión calientes y fríos: agua a 115 °C y 11 bar, nitrógeno líquido, máx. 2 bar helio y aire comprimido, ácidos y bases, campos magnéticos (6,7 T) y electricidad (230 V). Además, deben tenerse en cuenta las líneas de helio presurizado, las botellas de gas estándar (por ejemplo, 200 bar), así como cualquier peligro químico. La disolución (calentamiento, presurización y extracción) se lleva a cabo de manera bien controlada detrás de puertas transparentes y cerradas, de modo que se proporciona protección contra salpicaduras y astillas (aunque no ocurrió tal evento). Después de la disolución, el medio se ha enfriado lo suficiente a ≈ 37 °C, si es necesario, se puede colocar un frasco de hielo debajo del vial receptor. Las bajas temperaturas están presentes mientras se congela la muestra en N2 líquido, y las precauciones incluyen el uso de equipo de seguridad adecuado (guantes, gafas).

Como el imán no contiene criógenos líquidos, las precauciones de seguridad se pueden ajustar en consecuencia. No se necesita un tubo de enfriamiento, ya que la cantidad de helio gaseoso que se usa para enfriar el VTI es de solo 50 litros estándar, aunque hay más helio en el criostato de He de ciclo cerrado.

El sistema brinda acceso completo a más de 4 lecturas de sensores, todas las cuales se almacenan continuamente para su posterior recuperación. Encontramos que esta es una característica excelente y esencial, que permite una documentación y reconstrucción precisas de las condiciones experimentales. La interfaz de software (LabView) proporciona control sobre muchos parámetros esenciales de DNP, y el usuario o el fabricante pueden agregar nuevas funciones. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la temperatura de la muestra en sí no se puede medir directamente y se estima midiendo la temperatura del VTI.

La mayoría de las piezas son fácilmente accesibles para reparaciones o modificaciones, por ejemplo, para ajustar la cantidad de sustancia hiperpolarizada o para suministrar aire filtrado al recinto. Como la mayoría de las válvulas funcionan con aire comprimido, no se observó calentamiento ni fusión de las válvulas.

Cambiar entre diferentes núcleos sintonizando o intercambiando el circuito LC fue muy conveniente para monitorear la hiperpolarización de diferentes núcleos.

Usando las rutinas de polarización descritas anteriormente, se logró una hiperpolarización en estado líquido robusta y confiable: P(13C) con (ttrans = 19 s ± 1 s) = (38 ± 6)%, y una polarización estimada en la disolución de P(13C) en t0 ≈ (47 ± 7)% (Cuadro 7). Dado que no se conoce con precisión el decaimiento real de la muestra durante la transferencia a través de campos magnéticos fuertemente variables, la polarización en el momento de la disolución es una estimación. La acumulación de la polarización de estado sólido arrojó una constante de tiempo de ~ 17 min, lo que permite disoluciones repetitivas con un ciclo de trabajo inferior a dos horas, que puede acelerarse aún más si surge la necesidad. Los datos informados se adquirieron después de que se elevó el nivel de helio líquido en el VTI al sumergir un disco en el líquido. Esta modificación dio como resultado tiempos de acumulación menos variables: cv(TDNP) = 2,1 % y 22,8 % con y sin arandela, respectivamente. Es relevante señalar que la temperatura dentro del VTI no es necesariamente la temperatura de la muestra dentro del vial.

Curiosamente, la señal de 13C-RMN de piruvato en la muestra disuelta después de la hiperpolarización mostró una variación relativamente grande, cv(SlsTH) = 13,1 %. Este resultado puede indicar una concentración variable de piruvato, lo que sugiere una disolución no homogénea.

Hay pocos datos publicados con respecto a la reproducibilidad en la literatura, pero el rendimiento absoluto es comparable a lo que se informó antes (1-13C-PA con radical tritilo, es decir, 36–64 %35). Por supuesto, una transferencia de muestras más rápida y reproducible mejorará la importancia de estos números; un sistema de entrega dedicado se presentará en otra parte.

Sintonizar la bobina de RMN del DNP con otros núcleos fue fácil ya que el circuito LC se colocó en una caja blindada fuera del VTI. Para frecuencias de resonancia cercanas a 13C (como 129Xe), fue suficiente ajustar los condensadores variables. Para otros núcleos se utilizó un circuito LC diferente. Lo demostramos utilizando urea 15N, cuya relación giromagnética es aproximadamente 1/10 de la de 1H y 40% de 13C, y obtuvimos una polarización de 5,6% en el espectrómetro.

Durante el curso de este estudio, menos del 5% de todos los experimentos fallaron. La mayoría de estos fueron durante la disolución y antes de que se implementaran los procedimientos de limpieza. Entre los problemas encontrados estaban:

Como los tubos para la disolución tienen una superficie lisa para asegurar un cierre hermético, se descubrió que el mecanismo de descenso se deslizaba a veces. Este problema se solucionó fácilmente asistiendo suavemente la inserción manualmente. Un problema más serio ocurrió después de tres semanas de uso continuo, cuando tuvimos problemas para bajar la muestra al imán. Asumimos que esto fue causado por el hielo que comenzó a formarse dentro del tubo utilizado para insertar la muestra, posiblemente causado por pequeñas fugas o la frecuente inserción/expulsión de la copa de muestra. El problema se resolvió calentando el VTI, por lo que implementamos un procedimiento de limpieza semanal (calentando el VTI a aproximadamente 180 K en ≈ 10 h y evacuación de gas (1 h) por bomba de vacío, seguido de enfriamiento a ≈ 1,4 K en ≈ 5 horas). Este procedimiento se puede realizar automáticamente, por ejemplo, durante el fin de semana.

Para obtener una polarización de estado sólido consistente, resultó esencial congelar la muestra en la copa (en nitrógeno líquido) antes de insertarla en el imán. De esta forma se evitaba que la muestra salpicara durante la presurización, de manera que la muestra se quedaba en el fondo del vaso. Además, una falta de coincidencia entre las frecuencias del transmisor (ESR y NMR) y las frecuencias de Larmor (causada por la desviación del campo magnético) puede provocar la pérdida de polarización, por lo que se necesitan ajustes periódicos. Además, es relevante subrayar la importancia de mantener el vial de la muestra en He líquido durante la acumulación, para asegurar la transferencia de la mayor polarización de electrones. Debido a la relación entre hiperpolarización y T, cualquier temperatura superior a 3 K implica pérdidas considerables en la polarización.

Para evitar una disolución defectuosa, era esencial secar el módulo de disolución dos veces lavando todos los tubos con aire comprimido durante 7-10 min antes de iniciar el procedimiento de polarización mediante la inserción de la muestra. Dado que los tubos y conectores para la disolución estuvieron expuestos a temperaturas y presiones muy variables, se requiere un mantenimiento regular. En más de 100 disoluciones, observamos una falla material en el camino de disolución hasta el momento (tubo roto, razón poco clara).

Obviamente, los tiempos y campos magnéticos variables durante la transferencia provocarán polarizaciones variables. Mejoramos este problema llenando los tubos de RMN en la parte superior del imán, donde el campo es de ~ 10 mT, y usando un imán resistivo de 12 mT para transferir la muestra a la RMN de 9,4 T. El uso de espectrómetros de RMN de campo bajo para detectar la señal mejorada de 13C es una ventaja, ya que se pueden colocar cerca del sistema DNP. Sin embargo, la cuantificación de la polarización es más difícil ya que la sensibilidad es limitada, lo que requiere el uso de un agente de relajación de gadolinio y un promedio masivo para adquirir suficiente SNR del 13C térmico (no se observó señal para 15N).

En este documento, compartimos nuestra experiencia, resultados y consejos para operar el polarizador SpinAlinger de más de 100 experimentos en el transcurso de un año.

En general, el polarizador resultó ser confiable, compacto, fácil de usar y con alta polarización. Otras ventajas incluyen la ausencia de criógenos líquidos, un ciclo de trabajo corto y un diseño modular abierto que, por ejemplo, permite monitorear señales de estado sólido de diferentes núcleos. Estimamos la polarización en estado líquido de 1-13C-PA después de la disolución en (38 ± 5,7) % y 15N2-urea en (5,6 ± 0,8) %, suficiente para obtener imágenes metabólicas como se demostró con éxito aquí.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de Zenodo, en el siguiente https://doi.org/10.5281/zenodo.5957503.

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Agradecemos el apoyo de la unidad de investigación miTarget (FOR 5042), el grupo de formación en investigación "materiales para el cerebro" (GRK 2154/1-2019), Programa Emmy Noether "MR metabólico y molecular" (HO 4604/2-2), DFG otorgar INST 257/616-1 (FUGG), el SFB "reacción en masa" (TRR 287), los grupos de excelencia "medicina de precisión en inflamación" (PMI 2167) y el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) en el marco del concepto de investigación y financiación de e:Med (01ZX1915C) y DFG PR-1868/3-1 (TryIBD). La Universidad de Kiel y la Facultad de Medicina son reconocidas por apoyar al Centro de Competencia del Norte de Imágenes Moleculares (MOIN CC) como una instalación central para la obtención de imágenes in vivo. MOIN CC fue fundado por una subvención del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (ERDF) y el Zukunftsprogramm Wirtschaft de Schleswig-Holstein (Proyecto n.º 122-09-053). Adicionalmente, expresamos nuestro infinito agradecimiento al Dr. Andrea Capozzi por su apoyo. Además, agradecemos al Sr. Thomas Griebenow y al Prof. Dr. Rainer Herges por las mediciones del espectrómetro UV-Vis para definir la concentración real de la muestra disuelta. Además, queremos expresar nuestro más profundo agradecimiento a Polarize por su constante ayuda. Agradecemos a Franz Schilling y Geoffrey Topping por proporcionarnos el software personalizado basado en Matlab para el análisis y la visualización de 13C-CSI. Se puede consultar a Franz Schilling para que el software esté disponible. Agradecemos a Stephan Düwel por proporcionar el software para procesar los datos de CSI.

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Sección de Imágenes Biomédicas, MOIN CC, Departamento de Radiología y Neurorradiología, Centro Médico Universitario Schleswig-Holstein, Universidad de Kiel, Kiel, Alemania

Arianna Ferrari, Josh Peters, Mariia Anikeeva, Andrey Pravdivtsev, Frowin Ellermann, Kolja Them, Olga Will, Eva Peschke y Jan-Bernd Hövener

Laboratorio de Imágenes Funcionales y Metabólicas, Instituto de Física, EPFL (Ecole polytechnique fédérale de Lausanne), Lausanne, Suiza

Hikari Yoshihara

Departamento de Radiología y Neurorradiología, Centro Médico Universitario Schleswig-Holstein, Universidad de Kiel, Kiel, Alemania

olaf jansen

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AF, JP, MA y AP realizaron los experimentos. AP ayudó con la configuración de los experimentos de RMN y RMN. OW y EP asistido con experimentos in vivo. AF, JP, MA, AP y JBH escribieron el primer borrador del artículo. JBH diseñó, adquirió y supervisó el proyecto. Todos los autores colaboraron en la revisión crítica del artículo y aprobaron la versión final.

Correspondencia a Arianna Ferrari o Jan-Bernd Hövener.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ferrari, A., Peters, J., Anikeeva, M. et al. Rendimiento y reproducibilidad de la hiperpolarización 13C y 15N utilizando un polarizador DNP sin criógeno. Informe científico 12, 11694 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15380-7

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Recibido: 31 enero 2022

Aceptado: 23 junio 2022

Publicado: 08 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15380-7

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