Antagonismo del receptor NMDA dirigido farmacológicamente por NitroMemantine para la enfermedad cerebrovascular - Almacenamiento criogénico Co., Ltd de Chengdu

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 14781 (2015) Citar este artículo

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Un Corrigendum a este artículo fue publicado el 12 de febrero de 2016

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Los accidentes cerebrovasculares y la demencia vascular son las principales causas de morbilidad y mortalidad. Se han propuesto terapias neuroprotectoras, pero ninguna ha demostrado ser clínicamente tolerada y efectiva. Si bien se cree que la sobreestimulación de los receptores de glutamato de tipo N-metil-d-aspartato (NMDAR) contribuye a las agresiones cerebrovasculares, la importancia de los NMDAR en la función fisiológica ha convertido a este objetivo, al menos en opinión de muchos en 'Big Pharma', 'no drogable' para esta indicación. Aquí, describimos nuevos fármacos de nitromemantina, que comprenden un resto de adamantano que se une al canal iónico asociado a NMDAR que se usa para dirigir un grupo nitro a sitios reguladores mediados por redox en el receptor. Las nitromemantinas son bien toleradas y eficaces contra el infarto cerebral en modelos de roedores a través de un mecanismo alostérico dual de bloqueo de canales abiertos y modulación NO/redox del receptor. La nitrosilación S dirigida de NMDAR por NitroMemantine es potenciada por la hipoxia y, por lo tanto, dirigida a las neuronas isquémicas. Los enfoques alostéricos para ajustar la actividad de NMDAR pueden tener potencial terapéutico para los trastornos cerebrovasculares.

La isquemia cerebral focal (ictus) y la demencia vascular (debido a múltiples accidentes cerebrovasculares en la microvasculatura) representan las principales causas de disfunción cognitiva grave y muerte en todo el mundo1. Si bien se reconoce que la estimulación excesiva de los receptores de glutamato de tipo N-metil-d-aspartato (NMDAR) es importante en la etiología del daño cerebrovascular2,3, se descubrió previamente que los antagonistas de NMDAR eran ineficaces o clínicamente intolerables para las lesiones isquémicas cerebrales en humanos a pesar de los primeros resultados prometedores en modelos animales4,5,6. Por lo tanto, muchos en 'Big Pharma' han hecho la suposición tácita de que los NMDAR no son 'medicables' para los ataques cerebrovasculares. Sin embargo, existe la posibilidad de que, en lugar de que el objetivo sea intratable, los antagonistas específicos utilizados no se diseñaron adecuadamente. Los datos presentados aquí respaldan la premisa de que se debe revisar el caso de los antagonistas de NMDAR.

Un concepto importante relativamente nuevo se refiere a la población de NMDAR que se activan excesivamente durante la isquemia cerebral y la demencia vascular. La evidencia reciente respalda la idea de que, en la mayoría de las condiciones, la actividad patológica está mediada predominantemente por NMDAR extrasinápticos, mientras que la actividad fisiológica de NMDAR sináptico desencadena vías moleculares neuroprotectoras en las neuronas7,8. Un antagonista de NMDAR bien estudiado en particular, la memantina9, representa un fármaco no competitivo/rápido ('OVNI'), que afecta principalmente a los NMDAR extrasinápticos/activados tónicamente sobre los NMDAR sinápticos/activados fásicamente10,11,12,13. De hecho, la memantina se ha mostrado prometedora no solo en estudios con animales de accidente cerebrovascular sino también en un ensayo clínico de fase 2 en humanos para determinar su eficacia en la demencia vascular14,15,16,17. No obstante, a pesar de su aprobación por la FDA y la EMA para la enfermedad de Alzheimer de moderada a grave, el fármaco no se ha probado en ensayos avanzados adicionales para la enfermedad isquémica debido a sus efectos bastante modestos. Aquí, desarrollamos y caracterizamos análogos mejorados de memantina, que representan nitratos de aminoadamantano que demuestran una mayor eficacia y seguridad en modelos animales de isquemia cerebral. Es importante destacar que la demostración detallada de la selectividad del objetivo, las propiedades electrofisiológicas y los efectos neuroconductuales del candidato principal, denominado YQW-036/NMI-6979 NitroMemantine18,19, proporciona un perfil terapéutico prometedor. Los primeros estudios farmacocinéticos también indican que este fármaco puede representar un candidato viable para enfermedades relacionadas con la isquemia cerebral.

Mostramos aquí que las nitromemantinas ofrecen una ventaja sobre la memantina, al menos en parte, porque los nuevos fármacos manifiestan un sitio de acción dual en el NMDAR; en consecuencia, NitroMemantine funciona de manera superior a la memantina en el tratamiento de un modelo de rata con enfermedad cerebrovascular focal. El resto de memantina, que preferentemente bloquea los canales operados por NMDAR excesivamente abiertos en las neuronas que sufren una lesión isquémica, se usa para dirigir un grupo generador de NO a los sitios de modulación redox de esos NMDAR; estos sitios redox luego se someten a S-nitrosilación para causar la desensibilización del canal, lo que da como resultado una acción dual de los fármacos de nitromemantina a través del bloqueo del canal acoplado a la modulación redox alostérica11,18,20. Los resultados muestran que NitroMemantine ofrece una protección significativamente mayor que la memantina contra las agresiones isquémicas cerebrales, al tiempo que evita una mayor proporción de transmisión sináptica. Quizás lo más importante, NitroMemantine es un ejemplo de un fármaco aprobado por la FDA (memantina) que se utiliza para dirigir un segundo resto al mismo receptor para mejorar la eficacia de la acción. Este principio puede servir como una nueva plataforma para el descubrimiento de fármacos clínicamente tolerados en el SNC.

Hemos demostrado previamente que el NMDAR puede ser antagonizado por memantina a través del bloqueo de canal abierto10,14, así como por compuestos a base de óxido nítrico (NO) a través de un sitio alostérico modulador redox que está sujeto a S-nitrosilación20,21 ,22. Además, demostramos que la memantina interactúa preferentemente con canales asociados al NMDAR excesivamente (patológicamente) abiertos11,13. Además, durante la hipoxia, los compuestos basados en NO reaccionan preferentemente con los residuos de cisteína alostérica en el NMDAR para limitar la actividad excesiva22. En un esfuerzo por combinar estos atributos y producir un fármaco funcional dual que se dirija al grupo NO para abrir patológicamente los canales acoplados a NMDAR, 'montamos a cuestas' en memantina un grupo NOx (donde x = 1 o 2). Para este propósito, inicialmente sintetizamos varios cientos de derivados de nitromemantina (y andamios de control) para realizar una relación estructura-actividad detallada (SAR) de estos nuevos fármacos19. De estos, una serie de fármacos se mostró particularmente prometedora y poseía un grupo nitro (−NO2) opuesto a la amina cabeza de puente (−NH2), que se protona (−NH3+) a pH fisiológico (Fig. 1a; consulte Métodos complementarios para obtener detalles de la química síntesis)18. Hemos demostrado previamente que, a través de esta amina cabeza de puente, la memantina se une en o cerca del sitio Mg2+ del NMDAR, particularmente en la subunidad23 GluN1 (anteriormente denominada NR1).

Bloqueo de canales de corrientes mediadas por NMDAR por varios fármacos de aminoadamantano.

(a) Estructura de aminoadamantano y nitratos de aminoadamantano. El clorhidrato de 1-aminoadamantano (memantina) tiene cadenas laterales de metilo (grupos 'R') y no contiene un grupo nitro en el extremo posterior de la molécula. Con la adición del grupo nitro para la funcionalidad redox, disminuye la afinidad del resto aminoadamantano por el canal iónico asociado al NMDAR. Sin embargo, el alargamiento de las cadenas laterales 'R' compensa esto. Mientras que la memantina y el YQW-035 tienen cadenas laterales de metilo, el YQW-012 solo tiene protones, el YQW-036 tiene grupos etilo y el YQW-037 grupos propilo. El alargamiento de las cadenas laterales no solo aumenta la afinidad de unión en el canal, sino que también aumenta la lipofilicidad y, por lo tanto, la penetración de la barrera hematoencefálica, al tiempo que disminuye la solubilidad acuosa. (b) La amantadina (10 μM) inhibía menos corriente de NMDA en estado estacionario que la memantina equimolar. Equimolar NitroMemantine YQW-035 manifiesta menos bloqueo de canales que memantina pero más que amantadina. Por el contrario, NitroMemantine YQW-036 bloquea el canal en estado estacionario en aproximadamente el mismo grado que la memantina. Pinza de voltaje de dos electrodos de ovocitos que expresan receptores GluN1/GluN2A recombinantes a un potencial de retención (Vh) −70 mV. Los valores son media + sem (c) Respuesta a la dosis de nitromemantina YQW-035 a Vh = −70 mV. Los valores son la media ± sem (d) dosis-respuesta de nitromemantina YQW-036 a Vh = −70 mV. Los valores son la media ± sem (e) En las neuronas corticales primarias de rata, los registros de pinzamiento de parche de células completas revelaron que 5 μM de memantina o NitroMemantine YQW-036 produjeron un grado de bloqueo aproximadamente equivalente a -75 mV y menos bloqueo a +30 mV. indicando la dependencia del voltaje del bloque por el resto de memantina. En el histograma, para cada punto de datos, n ≥ 5 registros por fármaco probado; barra izquierda en cada par para respuestas a −75 mV y barra derecha para respuestas a +30 mV. Los valores son media + sem

Hemos estudiado en detalle varios de estos compuestos de nitromemantina, que utilizan el sitio de unión de memantina de alta afinidad en los NMDAR para dirigirse al grupo NOx para la interacción con el sitio de nitrosilación S/redox externo al sitio de unión de memantina. En particular, encontramos que al agregar el grupo funcional –ONO2 de nitroglicerina a la memantina (representado por el compuesto YQW-035), disminuimos la potencia del bloqueo del canal en estado estacionario durante los registros electrofisiológicos de ovocitos de rana que expresan NMDAR recombinantes (Fig. 1b) . Descubrimos que al alargar las cadenas laterales de memantina podíamos compensar la pérdida de afinidad por el fármaco en el canal asociado con la adición del grupo –ONO2. YQW-036 (con grupos etilo) representa la longitud preferida de la cadena lateral, ya que YQW-037 (con grupos propilo) no se puede disolver en soluciones acuosas. El IC50 de la inhibición de la corriente inducida por NMDA para adiciones a corto plazo de YQW-35 (que tiene grupos laterales de metilo similares a la memantina) y YQW-36 (en el que los grupos laterales se han alargado a etilo) son 6,3 y 2,4 μM, respectivamente. , cuando se mide en condiciones de estado estacionario después de la adición del fármaco a corto plazo durante los registros de pinzamiento de voltaje a un potencial de retención de -70 mV (Fig. 1c, d). Estos valores pueden compararse con la IC50 de memantina (0,5-1 μM) y amantadina (~35 μM)10,24. Por lo tanto, el fármaco de nitromemantina denominado YQW-036 manifiesta una afinidad por el canal iónico operado por NMDAR que se aproxima a la de la memantina. Si bien estos valores se obtuvieron en ausencia nominal de Mg2+ extracelular, hemos demostrado que YQW-036 también bloquea las corrientes evocadas por NMDA en presencia de concentraciones normales de Mg2+ (Fig. 1 complementaria).

Además, estos nuevos compuestos, como la memantina, muestran una inhibición dependiente del voltaje de las corrientes evocadas por NMDA en registros de neuronas cerebrocorticales de rata, como se esperaba para un bloqueador de canal abierto cargado positivamente (Fig. 1e). Sin embargo, esta propiedad puede explicar en parte la eficacia clínica relativamente débil de la memantina. Cuando las neuronas se comprometen energéticamente y, en consecuencia, se despolarizan debido a la irrupción de iones Na+ y Ca2+ cargados positivamente25,26, la memantina es repelida del canal iónico. Así, las neuronas 'más enfermas', las que más necesitan neuroprotección, se vuelven vulnerables.

En un intento de remediar esta deficiencia, los aductos de nitromemantina manifiestan una segunda inhibición basada en redox de la corriente inducida por NMDA. Este sitio de acción alostérico adicional produce una inhibición relativamente duradera de los NMDAR resultantes de la nitrosilación de S que está mediada por el grupo nitro, como se demuestra en los registros de ovocitos sujetos a voltaje (Fig. 2a)20,27,28. A diferencia del bloqueo del canal por el resto de memantina, este segundo efecto alostérico requiere varios minutos de adición del fármaco para el inicio de la acción (y por lo tanto no es evidente en las adiciones a corto plazo en la Fig. 1) y sobrevive al lavado por muchos minutos20,27,28. Para asegurarnos de que la nitromemantina no haya entrado en el canal durante el período de lavado, a diferencia de lo que ocurre durante la adición posterior del agonista como se esperaba de un bloqueador de canal abierto, analizamos los tiempos de subida de las respuestas evocadas por NMDA individuales antes y después de la adición de YQW-036; encontramos que los tiempos de subida eran similares (recuadro en la Fig. 2c), como se esperaba si el antagonista ya no residía en el canal, es decir, atrapado, antes de la adición del agonista10,29. Podemos distinguir aún más el efecto redox del grupo nitro del bloque de canales del núcleo de aminoadamantano de dos maneras adicionales. Primero, el efecto de la nitrosilación S se anula mediante la mutación sistemática de cinco residuos de cisteína (Fig. 2b). Es importante destacar que trabajos anteriores han demostrado que la mutación de estos mismos residuos de cisteína no afecta otras propiedades del NMDAR, incluida la inhibición en el sitio de unión de Mg2+/memantina en el canal20,30. Tenga en cuenta también que en condiciones de aire ambiente, como se prueba aquí, la mayoría del efecto está mediado por Cys399 en la subunidad GluN2A (anteriormente denominada NR2A). Sin embargo, como se demostró previamente22, la inhibición por el grupo nitro aumenta notablemente en condiciones hipóxicas relacionadas con el accidente cerebrovascular y la demencia vascular; en estas condiciones, otros cuatro residuos de cisteína en GluN1 y GluN2 contribuyen al efecto de S-nitrosilación. En segundo lugar, la S-nitrosilación, a diferencia del bloqueo del canal, se puede prevenir mediante la incubación previa con una molécula pequeña, un agente reactivo con sulfhidrilo como el metanotiosulfonato de etilamonio (MTSEA), que reacciona con los mismos residuos de cisteína y, por lo tanto, ocluye el efecto del grupo nitro (Fig. .2c–e).

Efectos redox de NitroMemantine YQW-036 mediados por S-nitrosilación.

( a ) Grabaciones representativas bajo abrazadera de voltaje de dos electrodos en ovocitos que expresan subunidades NMDAR mutantes de cisteína de tipo salvaje (WT) o no nitrosilables. ( b ) Cuantificación de la contribución de los residuos de cisteína en varias subunidades NMDAR al efecto inhibitorio de la nitrosilación S (los datos son media + sem para n ≥ 5 grabaciones por punto de datos, ** P < 0.01). (c) En los registros de ovocitos de corrientes provocadas por NMDA bajo tensión de fijación, la inhibición por NitroMemantine (10 μM) ocluyó en gran medida cualquier efecto adicional de la aplicación posterior del reactivo reactivo con sulfhidrilo MTSEA (0,5 mM), como se esperaba si los mismos residuos de cisteína fueran involucrado. Recuadro: escala de tiempo ampliada para mostrar el tiempo de subida de la corriente evocada por NMDA antes y después de la adición de nitromemantina. (d) La inhibición de las corrientes provocadas por NMDA por MTSEA ocluye el efecto inhibidor mediado por redox de la adición posterior de NitroMemantine. (e) Cuantificación de los efectos mostrados en c y d. Los datos son la media + sem para n ≥ 6 registros de ovocitos por punto de datos (*P < 0,005). (f) NitroMemantina inhibe la actividad de NMDAR por S-nitrosilación. La adición de 100 μM de nitromemantina YQW-036, pero no su metabolito memantina-OH, inhibió la corriente provocada por NMDA en los ovocitos que expresan GluN1/GluN2A NMDAR registrados en condiciones de pinzamiento de voltaje utilizadas para observar la nitrosilación S (Vh = −60 mV; datos representativos de n ≥ 4 registros de ovocitos). ( g ) La mutación del sitio de unión de memantina en la subunidad GluN1 de NMDAR evita el efecto redox de NitroMemantine. La interrupción del sitio de unión de memantina por la mutación GluN1 (N616R) anuló la actividad mediada por redox de NitroMemantine (100 μM). Datos representativos de n ≥ 3 registros de ovocitos.

La unión de memantina en el canal asociado a NMDAR se anula en gran medida por mutación en o cerca del sitio Mg2+, por ejemplo, en NMDAR con composición de subunidades GluN1(N616R)/GluN223,31. Probamos la capacidad de la estructura central de aminoadamantano para dirigir NOx a los sitios de S-nitrosilación/redox externos al sitio de unión a memantina en el canal mediante la mutación del sitio de unión a memantina. Dado que la mutación del canal provocó corrientes más pequeñas que las de los NMDAR de tipo salvaje (WT), en estos experimentos fue necesario utilizar concentraciones relativamente altas (p. ej., 100 μM) de nitromemantina para aumentar la magnitud del efecto. Comparamos nuestro principal fármaco de nitromemantina, YQW-036, con el andamiaje de 1-amino-3′,5′-dietil-7-hidroxi-adamantina sin el grupo nitro (designado aquí como memantina-OH)18,19. Descubrimos que la mutación del sitio de unión de memantina anuló en gran medida la actividad de NitroMemantines (Fig. 2f, g y Fig. 2 complementaria), mientras que una alta concentración de S-nitrosocisteína donante de NO (SNOC) inhibió tanto el NMDAR WT como el mutante ( Figura complementaria 2). Estos resultados indican que el resto central de aminoadamantano puede dirigir el grupo nitro al receptor; la mutación del sitio de unión de aminoadamantano impidió esta orientación.

Para confirmar aún más esta orientación, realizamos ensayos de cambio de biotina para medir las proteínas S-nitrosiladas luego de la administración sistémica de NitroMemantine YQW-036 en ratas que sufrieron un accidente cerebrovascular. La nitromemantina, pero no la memantina, produjo un aumento significativo de la nitrosilación S de la subunidad GluN1 del NMDAR (formando SNO-GluN1) en el parénquima cortical ipsilateral pero no contralateral al ictus (fig. 3). Por el contrario, la nitrosilación S de otras proteínas que hemos demostrado que están anómalamente nitrosiladas durante la neurodegeneración, por ejemplo, la proteína 1 relacionada con la dinamina (Drp1), no se vio afectada significativamente por la nitromemantina. Este experimento muestra el direccionamiento farmacodinámico del grupo nitro por NitroMemantine a NMDAR en el sitio del insulto fisiopatológico.

La nitrosilación S está dirigida al NMDAR por NitroMemantine.

(a) A ratas espontáneamente hipertensas (SHR) se les inyectó una dosis de carga de solución salina, vehículo, memantina (Mem) o nitromemantina (NitroMem) 2 horas después de la oclusión y luego se sacrificaron 90 minutos después. Se prepararon lisados cerebrales y se realizaron ensayos de cambio de biotina para detectar SNO-GluN1 y SNO-Drp1 de los hemisferios ipsilateral (accidente cerebrovascular) y contralateral (sin accidente cerebrovascular). (b) Los niveles de proteína SNO se presentan como la proporción de resultados ipsilaterales y contralaterales por encima del valor de referencia de referencia (media + sem; n ≥ 4 para cada valor, *P < 0,03 en comparación con el control mediante la prueba t).

La mayoría de los antagonistas de NMDAR producen anomalías neuroconductuales al bloquear la neurotransmisión normal; sin embargo, la memantina no presenta estos efectos secundarios9,11,12,32,33. Anteriormente, habíamos probado los fármacos memantina y nitromemantina en la preparación de autapsis del hipocampo de rata y en neuronas corticales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) y demostramos que bloqueaban preferentemente las respuestas mediadas por NMDAR extrasinápticas, lo que contribuía a la neurodegeneración7,13,18. Informamos que la adición a largo plazo de NitroMemantine fue más efectiva que la memantina equimolar en este sentido18. Aquí, mostramos que NitroMemantine YQW-036 (10 μM) evitó la actividad sináptica fisiológica en mayor medida que la memantina (Fig. 4a-c). Además, NitroMemantine ahorró la potenciación a largo plazo (LTP) (Fig. 4d, e), que representa el aumento de las corrientes sinápticas en respuesta a entradas sinápticas repetidas, que se cree que es un correlato eléctrico del aprendizaje y la memoria. Además, al igual que la memantina34, el laberinto acuático de Morris, una prueba neuroconductual para el aprendizaje espacial y la memoria, no se vio afectado por las dosis neuroprotectoras de nitromemantina (Fig. 4f)18,19,35.

Ausencia de efecto de NitroMemantine en EPSC, LTP y laberinto de agua de Morris.

( a ) Registros de células enteras de EPSC evocados de autapsis del hipocampo. El componente mediado por NMDAR del EPSC fue bloqueado en menor medida por 10 μM de nitromemantina YQW-036 que por 10 μM de memantina. El componente AMPA del EPSC se bloqueó con CNQX 20 μM. Como control, (2R)-amino-5-fosfonopentanoato (d-AP5) 50 μM, un antagonista competitivo del sitio de unión del glutamato, bloqueó completamente el componente NMDAR del EPSC. (b) El grado de bloqueo del EPSC no aumentó significativamente con la estimulación eléctrica repetida (pulsos 1–10) en presencia de NitroMemantine YQW-036. (c) El efecto inhibitorio de la memantina fue dependiente del uso con el décimo EPSC provocado más bloqueado que el primero. Por lo tanto, la memantina equimolar bloquea la neurotransmisión en mayor medida que la nitromemantina. Para cada panel, los datos son representativos de n ≥ 4 grabaciones de abrazadera de parche. ( d ) La dosis neuroprotectora de NitroMemantine (NitroMem, 10 μM) no inhibió la LTP en CA1 del hipocampo inducida por ráfagas de alta frecuencia en cortes de hipocampo de rata. ( e ) Como control en los experimentos de LTP, MK-801 (equimolar, 10 μM) inhibió completamente la inducción de LTP (n ≥ 4 cortes para los paneles d y e). ( f ) Falta de efecto de NitroMemantine en el rendimiento del laberinto de agua de Morris. Prueba de laberinto de agua de ratas macho adultas espontáneamente hipertensas (SHR) tratadas con nitromemantina o vehículo. Las ratas se aclimataron al laberinto de agua el día 1 y luego se probaron en los siguientes 4 días, con 6 ensayos/día para un total de 24 ensayos. La posición de la plataforma se cambió todos los días y los puntos de liberación para cada prueba variaron de manera pseudoaleatoria. Todos los valores son medias ± sem; n = 5 para cada grupo. Los picos en las pruebas 7 y 13 representan el resultado de la primera prueba en los días 2 y 3 de prueba e indican que los animales exhibieron cierto grado de 'olvido' de la tarea durante la noche y tuvieron que volver a aprender. Para el día 4 (ensayo 19), los animales aprendieron la nueva posición de la plataforma más rápidamente.

Otra preocupación bien conocida sobre los antagonistas de NMDAR es su propensión a causar daño histológico en ciertas regiones del cerebro. Por ejemplo, los antagonistas de NMDAR de alta afinidad como MK-801 causan apoptosis neuronal, particularmente en el cerebro de roedores en desarrollo36,37. Sin embargo, encontramos que ni la memantina ni la nitromemantina indujeron la apoptosis neuronal en el cerebro en desarrollo en dosis clínicamente relevantes (Fig. 3 complementaria).

A continuación, probamos la capacidad del fármaco principal de nitromemantina YQW-036 frente a memantina para ofrecer neuroprotección utilizando un modelo de rata de isquemia cerebral focal que consiste en oclusión/reperfusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO/R), un modelo que nosotros y otros hemos detallado anteriormente34,38,39,40. Tenga en cuenta que elegimos deliberadamente un modelo muy grave de enfermedad cerebrovascular, de modo que estos animales murieron en menos de dos días si no se trataban; por lo tanto, para permitir la comparación, los animales tratados y no tratados se evaluaron tanto desde el punto de vista conductual como histológico un día después del accidente cerebrovascular. Inicialmente, probamos una dosis-respuesta completa de la concentración del fármaco y el tiempo de administración después del ataque para obtener una ventana terapéutica después del accidente cerebrovascular. Para obtener una neuroprotección significativa, descubrimos que podíamos retrasar el tratamiento hasta dos (pero no tres) horas después de la oclusión usando las dosis máximas factibles (MFD). Por lo tanto, para los presentes experimentos, utilizamos la MFD previamente determinada para la memantina como la dosis de carga (90,3 μmol/kg o 20 mg/kg)14,34, administrada por vía intraperitoneal (ip) en el momento de la reperfusión (es decir, 2- h post oclusión). Para NitroMemantine, solo se inyectó ~70 % de esta dosis de carga (65,8 μmol/kg) debido a los límites de solubilidad del fármaco. Posteriormente, se administró la dosis estándar de mantenimiento de 4,63 μmol/kg (1 mg/kg) de memantina cada 12 h14,34, mientras que la dosis de NitroMemantine se mantuvo al 70% (3,29 μmol/kg) de la dosis de mantenimiento de memantina. Ambos fármacos proporcionaron un grado significativo de protección histológica después de la isquemia focal (Fig. 5a). Sin embargo, es importante destacar que solo NitroMemantine produjo una mejora en las pruebas neuroconductuales funcionales que afectan el rendimiento motor, a pesar de que el MFD de NitroMemantine fue más bajo que el MFD de memantina (Fig. 5b). (Nota: los parámetros fisiológicos, incluidas las temperaturas craneal y rectal, la presión arterial y el panel metabólico, no se vieron afectados significativamente por la dosis de carga de memantina o nitromemantina (Tabla complementaria 1)).

NitroMemantina protección y mecanismo de acción.

(a) La nitromemantina y la memantina ofrecen protección histológica en el modelo tMCAO/R de rata. Se administraron dosis de carga de fármaco (o control de solución salina) 2 horas después de la oclusión, dosis de mantenimiento 12 horas después y los animales se sacrificaron a las 24 horas. Izquierda: una dosis más baja de YQW-036 (ver texto) protegió en mayor medida que la memantina, según lo evaluado mediante tinción con cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) (*P < 0,05 mediante ANOVA con posthoc Scheffé ). Derecha: secciones de cerebro coronal teñidas con TTC representativas en cada protocolo de tratamiento. (b) La nitromemantina, pero no la memantina, mostró un efecto protector en las pruebas neurológicas/conductuales objetivas (ver Procedimientos experimentales, *P < 0,05 por ANOVA con posthoc Scheffé). Número de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) analizadas en los paneles ayb: n = 9 para el grupo de solución salina; n = 4 para el grupo tratado con memantina; n = 5 para el grupo tratado con nitromemantina. (c) El tratamiento con nitromemantina redujo el tamaño del infarto en comparación con los controles de memantina, memantina-OH y vehículo (**P < 0,01 mediante ANOVA con posthoc Scheffé). Número de SHR analizados: n = 13 para el grupo de solución salina; n = 10 para el grupo tratado con memantina; n = 8 para el grupo tratado con nitromemantina; n = 7 para el grupo tratado con memantina-OH. Los valores son la media ± sem para cada panel. ( d ) Esquema de la acción de NitroMemantine. El resto de adamantano proporciona la entrega dirigida de un grupo NOx (donde x = 1 o 2) al NMDAR, proporcionando dos sitios de acción antagonista. Primero, un adamantano, como la memantina, ingresa y se une preferentemente a canales acoplados a NMDAR excesivamente abiertos. En segundo lugar, un grupo NOx reacciona con los sitios redox, compuestos por grupos tiol reactivos, fuera del campo de voltaje del canal (modificado de la referencia 12).

A continuación, para permitir una comparación directa, probamos las concentraciones equimolares de memantina, NitroMemantine y su producto de degradación, memantine-OH, usando el MFD de NitroMemantine. Observamos que la memantina y la memantina-OH no brindaron una protección significativa a esta dosis, mientras que la nitromemantina ofreció un beneficio significativo en el análisis histológico (Fig. 5c). Tomados en conjunto, estos hallazgos son consistentes con la noción de que NitroMemantine ofrece un resultado superior a la memantina para lesiones cerebrovasculares focales y que este beneficio adicional puede atribuirse a la administración dirigida del grupo nitro, lo que permite una mejor regulación alostérica del NMDAR.

En el presente estudio, describimos el mecanismo de acción de NitroMemantine, que proporciona un antagonismo regulado por hipoxia de doble sitio en el NMDAR (Fig. 5d). Las características de la nitromemantina que pueden conferir beneficios en las neuronas isquémicas son varias: 1. Bloqueo dependiente del voltaje de los canales NMDAR predominantemente extrasinápticos excesivamente abiertos; 2. Entrega dirigida del grupo nitro a los NMDAR por el andamio de memantina; y 3. Regulación alostérica de la nitrosilación S del canal por hipoxia. La selección del grupo nitro probablemente ocurre porque los bloqueadores de canales abiertos pasan una mayor proporción de su tiempo cerca de la boca del canal, lo que aumenta las probabilidades estadísticas de que el grupo nitro reaccione con los residuos de cisteína vecinales. NitroMemantine modula así el parámetro biofísico de "ganancia" de la actividad del canal al proporcionar dos "controles de volumen" alostéricos en el NMDAR41, representados por la acción de la memantina en el canal y la S-nitrosilación fuera de él. De esta manera, la actividad NMDAR extrasináptica excesiva puede ser regulada a la baja de manera más efectiva por NitroMemantine que por memantina sola11,18,20,23,32.

No está claro cómo ocurre precisamente la S-nitrosilación del canal. Los nitratos de alquilo, como la nitromemantina, no se nitrosan directamente ni liberan NO espontáneamente. Sin embargo, formarán tionitratos en reacción con tioles que pueden reorganizarse para formar sulfenilnitritos nitrosantes. Además, la red de cisteína en el receptor puede facilitar la química reductora que se requiere21,27,42. En última instancia, dado que el sitio de acción del grupo nitro es externo al campo de voltaje del canal, la contribución redox al antagonismo de NMDAR no disminuye a medida que la neurona se despolariza20,22,28. Por lo tanto, NitroMemantine puede regular a la baja la actividad excesiva de NMDAR en un punto en el que la memantina sola perdería eficacia.

Podría esperarse que el grupo nitro fuera dirigido al NMDAR solo durante períodos de bloqueo del canal abierto por el resto aminoadamantano, es decir, en presencia de agonista. Curiosamente, sin embargo, observamos un efecto redox de las nitromemantinas incluso cuando se añadió el fármaco durante un período prolongado entre las aplicaciones del agonista de NMDA. Estos resultados son comprensibles en base a la química física conocida de los aminoadamantanos, que tienen un coeficiente de partición de lípidos a agua muy alto (consulte la Información complementaria en la referencia 35 y las citas allí). Nuestra disminución observada en la solubilidad en agua de NitroMemantine sobre memantine muestra que la lipofilia aumenta aún más cuando se agrega el grupo nitro. Por lo tanto, los nitratos de aminoadamantano parecen permanecer en la membrana lipídica como un reservorio, listos para ingresar al canal tan pronto como se abra y luego también iniciar el efecto redox35. Podemos ver que YQW-036 no ha ingresado al canal antes de la aplicación de NMDA debido al tiempo de aumento similar de las corrientes inducidas por agonistas antes y después de la aplicación de antagonistas (Fig. 2c, recuadro). Si el nitrato de aminoadamantano ya estuviera en el canal antes de la aplicación de NMDA (es decir, atrapado en el canal cerrado), habría salido lentamente inmediatamente después de la aplicación del agonista, produciendo un tiempo de subida más lento de la corriente evocada por NMDA10,29. Como nota adicional, cuando se usó una concentración alta de YQW-036 (100 μM en lugar de 1 a 10 μM), el efecto lipofílico del fármaco se magnificó aún más, como es evidente en el lavado lento de un componente del efecto inhibidor sobre el agonista repetido. aplicaciones (Fig. 2f). No obstante, el hecho de que el efecto prolongado de YQW-036 se anuló en gran medida por la adición previa de MTSEA o la mutación de cisteínas activas redox en el NMDAR indica que este componente de la acción inhibidora del fármaco no puede atribuirse únicamente a una mayor lipofilicidad. Más bien, el componente principal del efecto inhibitorio prolongado de YQW-036 se explica mejor por la interacción en los sitios redox en el NMDAR porque fue prevenido por intervenciones químicas y moleculares en los residuos de cisteína que subyacen a la modulación redox del receptor20 . Además, el hallazgo de que la mutación del principal sitio de unión del resto aminoadamantano en el canal (GluN1 (N616R)) anuló en gran medida el efecto inhibidor prolongado de YQW-036 (Fig. 2g) es consistente con la noción de que la acción similar a la memantina del fármaco sirve para dirigir el grupo nitro al receptor. No podemos descartar la posibilidad adicional de que la S-nitrosilación por NitroMemantine también aumente la susceptibilidad del receptor al bloqueo de canales a través del resto de adamantano. Además, las propiedades lipofílicas de los nitratos de aminoadamantano deberían ser beneficiosas clínicamente porque aumentan la concentración de fármaco que atraviesa la barrera hematoencefálica; de hecho, debido a su lipofilia, se ha informado que los aminoadamantanos se concentran al menos 20 veces en el cerebro con respecto a los niveles plasmáticos (véanse las citas en la ref. 35).

Anteriormente habíamos publicado evidencia de que la memantina no se acumula en los canales asociados a NMDAR sinápticos debido, al menos en parte, a su tasa de desconexión relativamente rápida; por lo tanto, la memantina no afecta negativamente al componente mediado por NMDAR de las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC), la inducción de LTP dependiente de NMDAR o las pruebas de comportamiento como el laberinto acuático de Morris10,23,32. Se cree que el hecho de que la memantina respete principalmente la actividad sináptica/fásica mientras bloquea los NMDAR extrasinápticos/tónicamente activos es la base de su tolerabilidad clínica y eficacia clínica razonable en ensayos clínicos en humanos11,12,13. Por lo tanto, nuestro hallazgo de que NitroMemantine ahorra aún más actividad sináptica mientras antagoniza la actividad extrasináptica en un grado aún mayor que la memantina puede explicar la mayor eficacia del nuevo fármaco y es un buen augurio para su tolerabilidad clínica en pruebas en humanos18. Además, la potenciación hipóxica de la inhibición del receptor, como se observa con los compuestos basados en NO22, es una característica particularmente deseable en la isquemia. Por lo tanto, los antagonistas de NMDAR dirigidos alostéricamente y regulados por hipoxia, aunque de baja afinidad, pueden ser prometedores para los trastornos cerebrovasculares y otros trastornos neurodegenerativos18,19.

Todos los protocolos para el uso de animales vertebrados fueron aprobados por el Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute IACUC y todos los experimentos siguieron las pautas de ARAC. Otros métodos y cualquier referencia asociada se encuentran en la versión en línea del documento.

Sintetizamos nitratos de adamantano usando reacciones publicadas. Los esquemas y procedimientos sintéticos se describen en los Métodos complementarios.

Se realizaron registros de abrazadera de voltaje de dos electrodos a -60 o -70 mV en ovocitos en solución de Ringer de rana dos a siete días después de la inyección de subunidades NMDAR. Las grabaciones se realizaron con un amplificador Oocyte Clamp OC-725b (Warner Instrument Corporation, Hamden, CT) usando el software MacLab versión 3.5 (AD Instruments, Milford, MA) a temperatura ambiente. Los electrodos de inyección de corriente tenían una resistencia de 0,5 a 1 MΩ y los electrodos de detección de voltaje tenían una resistencia de 1 a 4 MΩ. Ambos electrodos se llenaron con KCl 3 M. Se usó una solución que contenía NaCl 90 mM, KCl 1 mM, HEPES 10 mM, BaCl2 1,5 mM y glicina 10–100 μM, pH 7,5 para superfundir continuamente los ovocitos. Se usó bario, en lugar de calcio, como catión divalente para minimizar la activación secundaria de la corriente de Cl− activada por Ca2+43. En algunos experimentos, se añadió MgCl2 1,2 mM a la solución del baño. Los fármacos se disolvieron en solución de Ringer de rana y se aplicaron por superfusión a un caudal de 2 ml/min. En algunos casos, para lograr un intercambio de solución relativamente rápido, usamos una matriz de pipetas similar al sistema de "tubería de alcantarillado" que se usa en el registro de abrazaderas de parche44. Los artefactos de perfusión se eliminaron digitalmente de las trazas.

Se utilizaron métodos establecidos para preparar cultivos cerebrocorticales primarios de rata y cultivos autápticos de hipocampo45,46,47. Brevemente, para cultivos corticales de rata, se diseccionaron cerebrocortices de ratas Sprague-Dawley embrionarias de día 16-17 (E16-17). Después de la disociación, las células se sembraron en placas recubiertas con poli-l-lisina en DMEM más Ham's F12 y suero de ternero complementado con hierro inactivado por calor al 10%. Los cultivos se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2/95 % de aire durante al menos tres semanas antes de su uso para asegurar que se expresara todo su repertorio de NMDAR. Para cultivos autápticos, en el día postnatal 0 (P0), se recolectaron células primarias de hipocampo de rata y se preparó una suspensión de una sola célula y se sembró en microislas de astrocitos de rata primaria en forma de punto. Las microislas se prepararon sembrando una suspensión unicelular de astrocitos en micropuntos de colágeno (62,5 μg/ml)/poli-d-lisina (50 μg/ml) en cubreobjetos de vidrio recubiertos con agarosa. Para los cultivos corticales, los registros de células enteras generalmente se realizaron en las neuronas después de la superfusión con tetrodotoxina (TTX) 1 μM para eliminar la actividad espontánea en los cultivos. Para los cultivos autápticos, se obtuvieron registros de células completas a partir de neuronas individuales que crecían en microislas de uno o más astrocitos. Las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente en cultivos de 14 a 26 días in vitro (DIV) con un amplificador de pinza de parche (Axopatch 200B o MultiClamp 700A Molecular Devices, Union City, CA). Las neuronas cultivadas se superfundieron a una velocidad de 2 ml/min con solución externa tamponada con HEPES (en mM): NaCl, 146; KCl, 2,5; CaCl2, 2; HEPES, 10; d-glucosa, 20; pH 7,4 (ajustado con NaOH), 300–310 mOsm. Se usaron capilares de vidrio de borosilicato (GC150F-10, Warner Instruments) para extraer pipetas de parche usando un extractor de micropipetas (P87, Sutter Instruments, Novato, CA); las resistencias de punta abierta fueron de 2–7 MΩ con solución interna (en mM): CsCl, 140; NaCl, 4; CaCl2, 0,5; HEPES, 10; Na-GTP, 0,5; Mg-ATP, 2; EGTA, 5; pH 7,33 (CsOH ajustado); 315 mOsm. Algunos experimentos utilizaron una solución intracelular basada en Cs-gluconato (en mM): Cs-gluconato, 117; NaCl, 9; HEPES, 10; y MgCl2, 2; EGTA, 10; pH 7,2 (ajustado con NaOH). Las corrientes mediadas por NMDAR se registraron en ausencia de magnesio extracelular y con glicina 10–20 μM. Los fármacos se administraron mediante un sistema de perfusión controlado por válvula rápida (Lee Company, Essex, CT). A menos que se indique lo contrario, todos los antagonistas se adquirieron de Tocris Bioscience (Ellisville, MO). Los datos se adquirieron y analizaron como señales eléctricas filtradas y digitalizadas utilizando el software PClamp v.10 (Axon Instruments, Union City, CA). Los datos se visualizaron y analizaron usando el paquete de software estadístico Origin 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA).

Las subunidades mutantes de NMDAR se prepararon usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio de doble cadena ChameleonTM (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se secuenció toda la región codificante para verificar la mutación.

Se trataron ratas adultas con hipertensión espontánea (SHR) con PBS o nitromemantina (dosis de carga de 65,8 μmol/kg, ip, seguida de una dosis de mantenimiento de 3,29 μmol/kg cada 12 h). Cada grupo estaba compuesto por cinco ratas (n = 5). El tratamiento para ambos grupos comenzó 48 h antes del primer día de prueba. Tanto el tratamiento como la prueba del laberinto de agua se realizaron de forma ciega. El laberinto de agua consistía en una piscina circular de 150 cm de diámetro y 85 cm de profundidad. La piscina se llenó hasta cubrir una plataforma móvil, de color negro, con 1 cm de agua. El agua se hizo opaca mediante la adición de pintura negra y se mantuvo a temperatura ambiente (20–23 °C) durante los cinco días de prueba. Un estanque blanco con agua negra permitió que la cámara de video rastreara con éxito a las ratas blancas con el máximo contraste. El día 1, las ratas se colocaron en la piscina sin plataforma durante 60 s de aclimatación. Se usaron los días 2 a 5 para la prueba. Comenzando el día 2 y continuando hasta el día 5, las ratas fueron entrenadas para un total de 24 ensayos (seis ensayos/día) para ubicar y alcanzar la plataforma sumergida. La plataforma se mantuvo en el mismo lugar para todas las pruebas en cada sesión (día), pero se cambió de una sesión a otra en un orden predeterminado, lo que produjo cuatro ubicaciones únicas en total. Además, había cuatro posibles lugares de liberación (los cuatro puntos cardinales de la brújula en el perímetro de la piscina). Los seis ensayos por sesión/día para cada animal se realizaron en parejas de diferentes lugares y todos los animales fueron evaluados antes de proceder a otro par de ensayos. Además, el orden de las ubicaciones de entrega era constante para todas las ratas, pero, al igual que la plataforma, tenía un orden pseudoaleatorio que cambiaba de una sesión a otra. Cada sesión de prueba del laberinto de agua se llevó a cabo de manera continua, sin grandes intervalos de tiempo entre las pruebas individuales o las rondas de pares de pruebas. El tiempo máximo permitido para que la rata alcanzara con éxito la plataforma fue de 120 s. Si el animal no llegaba a la plataforma en ese tiempo, se guiaba manualmente y se le daba un tiempo de 120 s. Entre las dos pruebas, la rata permaneció en la plataforma durante un mínimo de 5 s (este período de tiempo se excluyó para determinar la duración de la prueba).

Se sacrificaron ratas adultas (275–300 g) por decapitación. Los cerebros se extrajeron rápidamente del cráneo y se colocaron en líquido cefalorraquídeo artificial frío (ACSF), en mM: NaCl 116; KCl 5,37; NaHPO4 1,02; NaHCO3 26,19; CaCl2 3,2; MgSO4 0,8; d-glucosa 10, pH 7,4, saturada con 95 % O2/5 % CO2 burbujeado, a 6 °C. Los hipocampos se cortaron en rodajas con un grosor de 40 μm mediante un cortador manual de tejidos (Stoelting). Los cortes utilizados fueron del tercio medio del hipocampo, orientados en un plano perpendicular al eje septotemporal. Los cortes se transfirieron en ACSF frío a una cámara de interfaz de flujo continuo y se superfundieron a 33,5 °C. ACSF y la interfaz de aire se saturaron con gas burbujeado con 95% O2/5% CO2. Después de una incubación de 30 minutos, el líquido se cambió por ACSF fresco con o sin MK-801, memantina o nitromemantina y se incubó durante otros 60 minutos antes del registro electrofisiológico.

Los potenciales postsinápticos excitatorios del campo extracelular (EPSP) se registraron en el estrato radiatum de la región CA1 del hipocampo después de la estimulación de las colaterales CA3 Schaffer de acuerdo con nuestros protocolos previamente publicados34. Las grabaciones se realizaron con microelectrodos de vidrio llenos de ASCF (resistencia 1–2 MΩ); Para la estimulación se utilizaron electrodos bipolares de tungsteno (Fred Haer). Las respuestas se monitorearon con un amplificador de CA (AM Systems). Los electrodos de registro se colocaron en el estrato radiatum a una profundidad de aproximadamente 100 μm debajo de la superficie ya 1000 μm del electrodo de estimulación. Se evocaron los EPSP de campo y se generó una curva de entrada/salida para determinar la intensidad del estímulo necesaria para inducir una respuesta a la mitad del máximo. Los estímulos posteriores se administraron a esta intensidad. Se administraron estímulos de pulso emparejado a intervalos entre estímulos de 6 a 200 ms y para cada intervalo, se calculó el grado de inhibición o facilitación del pulso emparejado. Los valores de pendiente de los EPSP se utilizaron en el paradigma de prueba de pulsos emparejados. Solo se colocó un electrodo por corte para evitar lesiones en el corte. Durante 10 a 20 min, las respuestas iniciales se registraron cada 30 s. Después de un período de observación de una línea de base estable, se aplicó estimulación tetánica al corte (ráfaga de 100 Hz durante 1 s) y se aplicó cada 30 s durante 60–90 min. El cambio porcentual en la pendiente EPSP después del tétanos se comparó con la línea de base previa al tétanos. Se utilizó un ANOVA de medidas repetidas para comparar las pendientes de los diferentes grupos.

El análisis de la nitrosilación S de los receptores NMDA en cerebro de rata se realizó mediante el ensayo de cambio de biotina, como se describió previamente48,49. Los tioles libres en los lisados de tejidos se bloquearon con metanotiosulfonato de metilo. A continuación, las proteínas se precipitaron con acetona y se resuspendieron en tampón HEN (HEPES 250 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, neocuproína 0,1 mM) más dodecilsulfato sódico al 1%. Se usó ascorbato para reducir selectivamente los nitrosotioles con el fin de reformar los grupos tiol libres, que posteriormente se biotinilaron usando biotina-HPDP 1 mM (Pierce, Rockford, IL). Se realizaron reacciones paralelas sin ascorbato como control para asegurar la especificidad de las bandas biotiniladas. Las proteínas biotiniladas se capturaron en perlas de estreptavidina-agarosa y se analizaron mediante inmunotransferencia.

A ratas de siete días de edad se les inyectó por vía ip vehículo, MK-801, memantina o nitromemantina y los cerebros se examinaron 24 h más tarde mediante TUNEL (etiquetado de extremo de mella mediado por dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal) para detectar células apoptóticas. La cuantificación se realizó mediante el método de disector óptico y fraccionador (Cruz-Orive y Weibel, 1990). Brevemente, se utilizaron un objetivo de gran apertura y un marco de conteo (0,05 mm por 0,05 mm, altura del disector 0,07 mm) para visualizar y contar las neuronas. Se realizaron muestreos imparciales seleccionando aleatoriamente de 8 a 10 campos de visualización dentro del marco de conteo en diferentes niveles focales utilizando el método de disector óptico. La densidad de neuronas normales se determinó contando las neuronas en secciones de 70 μm de espesor teñidas con una tinción de Nissl (azul de metileno, azul II). El conteo se realizó de manera ciega.

Debido a su conocida propensión al accidente cerebrovascular, similar a los pacientes humanos con hipertensión, utilizamos ratas hipertensas espontáneas (SHR, Harlan) para inducir tMCAO/R con el método de sutura intraluminal34,38,39,40. Se anestesiaron machos de 200 a 300 g de SHR con isoflurano al 3 % en oxígeno al 30 %/óxido nitroso al 70 % utilizando un vaporizador anestésico y un flujómetro. La temperatura corporal se mantuvo a 37 °C con un sistema de temperatura homeotérmico. Se utilizó un monitor láser Doppler para monitorear el flujo sanguíneo cerebral relativo (rCBF) durante el procedimiento quirúrgico y la recuperación. Las mediciones de rCBF se realizaron inmediatamente después de la anestesia, después de la oclusión de la MCA, justo antes e inmediatamente después de retirar la sutura para iniciar la reperfusión. Para iniciar un accidente cerebrovascular, se hizo una incisión en la línea media para exponer las arterias carótida común derecha, carótida externa y carótida interna. Las ramas de la arteria occipital de la arteria carótida externa se aislaron y junto con las ramas terminales de la arteria lingual y maxilar se coagularon con una unidad de electrocauterio. Se aisló la arteria carótida interna y se separó cuidadosamente del nervio vago adyacente. La arteria pterigopalatina se ligó cerca de su origen, se colocaron dos suturas flojas alrededor del muñón de la arteria carótida externa y se aplicó un clip de microaneurisma a la arteria carótida externa cerca de su bifurcación con la arteria carótida interna. Se hizo una pequeña abertura de punción en la arteria carótida externa, se insertó un monofilamento (sutura intraluminal) a través de la abertura y se apretaron las suturas alrededor del lumen que contenía el filamento. El clip del microaneurisma se retiró de la arteria carótida externa y el monofilamento avanzó suavemente desde la luz de la arteria carótida externa hacia la arteria carótida interna en una distancia de ~19 a 20 mm más allá de la bifurcación de la arteria carótida común hasta que el flujo de sangre disminuyó. (≥80% de reducción por medición de rCBF). Se apretó la sutura alrededor del muñón de la arteria carótida externa para evitar el sangrado. Después de 2 h, se retiraron las suturas, se retiró el filamento y se retiró la incisión suturada, con una recuperación del rCBF de al menos un 75 % en la reperfusión. Justo antes de la reperfusión, a las ratas se les administró memantina, nitromemantina o memantina-OH mediante inyección ip en vehículo salino o un volumen equivalente de vehículo solo. En los experimentos iniciales, la dosis de carga de cada fármaco fue de 20 mg/kg, lo que corresponde a 90,3 μmol/kg de memantina y 65,8 μmol/kg de NitroMemantine YQW-036 (la dosis de NitroMemantine ∼30 % menor fue necesaria debido a su menor solubilidad). en solución acuosa). Las dosis de mantenimiento (4,63 μmol/kg de memantina y 3,29 μmol/kg de nitromemantina, equivalentes a 1 mg/kg o cada una) se administraron 12 h después de la dosis de carga. Como se demostró anteriormente, esta dosis de memantina produce una concentración neuroprotectora biológicamente eficaz de 5 a 10 μM en la boca del canal iónico asociado al NMDAR35. En experimentos posteriores, se utilizó memantina equimolar, nitromemantina YQW-036 o memantina-OH usando la dosis más baja de nitromemantina descrita anteriormente. Los roedores se sacrificaron 24 horas después de la oclusión y el tamaño del infarto cerebral se evaluó histológicamente mediante tinción con cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC)50.

Cada animal adulto se sometió a una evaluación neurológica51 inmediatamente después de la extracción del filamento y nuevamente 1 día después de la reperfusión (antes del sacrificio). A cada animal se le asignó una puntuación conductual objetiva de 0 a 4: 0 representa ningún déficit neurológico observable; 1 fracaso para extender la pata delantera izquierda; 2 dando vueltas a la izquierda; 3 cayendo a la izquierda; 4 no puede caminar espontáneamente. Las puntuaciones obtenidas 24 h después del accidente cerebrovascular se promediaron para cada punto de tiempo de cada grupo de tratamiento y se presentaron como la puntuación neurológica.

Los valores para los experimentos electrofisiológicos e histológicos se presentan como media ± sem Para probar las diferencias estadísticas entre los grupos, utilizamos una prueba t de Student (dos colas) para comparaciones bidireccionales y un ANOVA con pruebas post hoc para comparaciones múltiples. Para las pruebas de comportamiento, las pruebas no paramétricas (prueba de Mann-Whitney-U) evaluaron la importancia de las diferencias en las distintas condiciones. Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Cómo citar este artículo: Takahashi, H. et al. Antagonismo del receptor NMDA dirigido farmacológicamente por NitroMemantine para la enfermedad cerebrovascular. ciencia Rep. 5, 14781; doi: 10.1038/srep14781 (2015).

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Agradecemos a Mark Washburn por realizar experimentos preliminares sobre los primeros derivados de la serie de fármacos NitroMemantine, a Jonathan Stamler por su contribución original a la idea de la regulación alostérica terapéutica, el diseño de esta clase de compuestos y su ayuda para escribir el manuscrito, a Greg Went por su ayuda con el desarrollo de fármacos y Traci Fang Newmeyer y Ravi Agarwal por su excelente soporte técnico. Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones P01 HD29587, R01 EY05477, R21 NS080799 y P30 NS076411 del NIH, por la subvención W81XWH-13-0053 (a SAL) del Departamento de Defensa (Ejército), por una beca postdoctoral de la American Heart Association 09POST2120061 (a PX ) y por un Acuerdo de investigación patrocinado por una empresa de Adamas Pharmaceuticals, Inc.

María Talantova, Emily A. Holland, Nobuki Nakanishi, Scott R. McKercher, Tomohiro Nakamura y Stuart A. Lipton

Dirección actual: Centro de Enfermedades Neurodegenerativas, Instituto Scintillon, San Diego, CA, 92121

Gary Tong

Dirección actual: Lundbeck, Inc., Deerfield, IL, 60015

Takahashi Hiroto, Xia Peng y Cui Jiankun contribuyeron igualmente a este trabajo.

Centro de Investigación de Neurociencia y Envejecimiento, Instituto de Descubrimiento Médico Sanford-Burnham-Prebys, La Jolla, 92307, California, EE. UU.

Hiroto Takahashi, Peng Xia, Jiankun Cui, Maria Talantova, Karthik Bodhinathan, Wenjun Li, Sofian Saleem, Emily A. Holland, Gary Tong, John Pineapple-Crespo, Dongxian Zhang, Nobuki Nakanishi, Scott R. McKercher, Tomohiro Nakamura y Stuart A Lipton

Panorama Research, Inc., Sunnyvale, 94089, California, EE. UU.

James W. Larrick

Instituto de Investigación de Nuevos Medicamentos, Facultad de Farmacia de la Universidad de Jinan, Guangzhou, 510632, China

Yuqiang Wang

Departamento de Neurociencias, Facultad de Medicina de la Universidad de California en San Diego, La Jolla, 92039, California, EE. UU.

Stuart A. Lipton

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SAL diseñó y supervisó todos los experimentos y preparó el manuscrito. YW y JWL realizaron la síntesis química de nitratos de aminoadamantano, el análisis de la relación estructura-actividad y la optimización hit-to-lead. HT, PX, MT, TT, JP-C., KB y DZ realizaron o analizaron experimentos electrofisiológicos. JC y SS realizaron la cirugía para el modelo animal de isquemia cerebral con la asistencia de WLTN realizaron el ensayo farmacodinámico que muestra la nitrosilación S del receptor NMDA con la asistencia de EHSRM y NN ayudaron a analizar datos, realizaron análisis estadísticos, prepararon figuras y asistieron en experimentos. SAL y SRM escribieron el manuscrito y todos los coautores participaron en la edición del manuscrito.

Los autores declaran que SAL es el inventor de patentes mundiales para el uso de memantina y nitromemantina para trastornos neurodegenerativos; YW y JWL también son inventores de patentes de nitromemantina. Según las pautas de la Universidad de Harvard, SAL participa en un acuerdo de reparto de regalías con su antigua institución, el Boston Children's Hospital/Harvard Medical School, que otorgó la licencia del fármaco memantina (Namenda®) a Forest Laboratories/Actavis. Además, SAL y JWL son fundadores científicos de Adamas Pharmaceuticals, Inc., que ha desarrollado formulaciones de memantina de segunda generación con Forest/Actavis.

Este trabajo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la línea de crédito; si el material no está incluido bajo la licencia Creative Commons, los usuarios deberán obtener el permiso del titular de la licencia para reproducir el material. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Reimpresiones y permisos

Takahashi, H., Xia, P., Cui, J. et al. Antagonismo del receptor NMDA dirigido farmacológicamente por NitroMemantine para la enfermedad cerebrovascular. Informe científico 5, 14781 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14781

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Recibido: 11 de marzo de 2015

Aceptado: 09 de septiembre de 2015

Publicado: 19 de octubre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14781

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