La fabricación y evaluación de crema repelente de mosquitos para protección exterior.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 2180 (2022) Citar este artículo

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Las infecciones transmitidas por mosquitos como el dengue, la malaria, el chikungunya, etc. son una molestia y pueden causar un profundo malestar a las personas. Debido a los efectos secundarios objetables y la toxicidad asociados con los piretroides sintéticos, N,N-dietil-3-metilbenzamida (DEET), N,N-dietil fenilacetamida (DEPA) y repelente de mosquitos a base de N,N-dietil benzamida (DEBA) productos, desarrollamos una crema repelente de mosquitos a base de aceite esencial (EO) (EO-MRC) utilizando aceite de clavo, citronela y limoncillo. Posteriormente se realizó un estudio de caracterización de la formulación, bioeficacia y seguridad del EO-MRC. La expresión de las proteínas Anti-OBP2A y TRPV1 en las partes de la cabeza del mosquito se estudió mediante transferencia Western. También se realizó un cribado in-silico para las proteínas específicas. Un estudio FT-IR confirmó la compatibilidad química de los EO y los excipientes utilizados en EO-MRC. El comportamiento térmico de los mejores AE y su mezcla se caracterizó mediante análisis termogravimétrico (TGA). El examen GC-MS reveló varios componentes químicos presentes en los aceites esenciales. La eficacia de EO-MRC se correlacionó con la crema comercializada a base de N,N-dietil benzamida (DEBA) al 12% (DBMC). El tiempo de protección completa (CPT) de EO-MRC se determinó en 228 min. El estudio de citotoxicidad en la línea celular L-132 confirmó la naturaleza no tóxica de EO-MRC tras la inhalación. El estudio de irritación dérmica aguda, el estudio de toxicidad de dosis dérmica aguda y el estudio de irritación ocular aguda revelaron la naturaleza no tóxica de EO-MRC. El estudio de toxicidad no objetivo en Danio rerio confirmó que EO-MRC es más seguro para los animales acuáticos no objetivo. Se observó una disminución en la concentración de acetilcolinesterasa (AChE) en ratas Wistar expuestas a transflutrina (TNSF). Mientras que EO-MRC no alteró las concentraciones de AChE en los animales expuestos. Los resultados de la transferencia Western confirmaron que las proteínas Anti-OBP2A y TRPV1 se inhibieron en los mosquitos expuestos a TNSF. Los mosquitos expuestos a EO-MRC mostraron un patrón de expresión similar para Anti-OBP2A y TRPV1 que el grupo de control. El estudio in silico reveló que ocho compuestos identificados de los EO desempeñan un papel importante en la propiedad general de repelencia del producto desarrollado. El estudio enfatiza la actividad repelente de mosquitos de EO-MRC, que podría ser una alternativa efectiva, ecológica y más segura a los repelentes sintéticos existentes para la protección personal contra mosquitos en condiciones de campo.

Los mosquitos son los vectores clave de varias enfermedades tropicales, como la malaria, la filariasis y enfermedades virales como el dengue, el chikungunya, el Nilo occidental, la fiebre amarilla y el zika1,2,3,4. El dengue, propagado por Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse), está estrechamente asociado con las residencias humanas en las metrópolis5,6,7. Se ha documentado que las infecciones transmitidas por mosquitos son una de las principales causas de enfermedad entre los expatriados, viajeros y unidades militares desplegadas en el extranjero durante mucho tiempo, especialmente en áreas tropicales y subtropicales8. Se han registrado varias epidemias mayores y menores entre los EE. UU. y las fuerzas armadas extranjeras cuando se desplegaron en áreas endémicas de malaria de África Occidental, África del Norte, el Pacífico Sur y las fronteras entre China, Birmania e India durante la Segunda Guerra Mundial, la Guerra de Corea y Vietnam. Conflicto9,10,11.

Lamentablemente, no existen vacunas ni tratamientos específicos para la mayoría de las enfermedades transmitidas por mosquitos12,13. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente a la población de los países donde la enfermedad es endémica evitar las picaduras de mosquitos, principalmente mediante el uso de ropa adecuada y la aplicación de repelentes tópicos en las partes del cuerpo expuestas14,15,16. La prevención de las picaduras de mosquitos en espacios interiores se puede lograr mediante el uso de mosquiteros insecticidas de larga duración (LLIN) y aerosol residual interior (IRS), una recomendación emblemática de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Las formulaciones de vaporizadores eléctricos repelentes de mosquitos son efectivas para reducir la densidad de mosquitos en áreas interiores. Por lo general, se aplican repelentes en forma de crema, gel y lociones sobre la piel expuesta para obtener protección contra las picaduras de mosquitos en condiciones al aire libre17. Los repelentes tópicos tienden a ser compuestos de baja volatilidad18 que proporcionan una barrera de vapor sobre la piel o que se evaporan lentamente en el aire ambiental y protegen a los artrópodos19,20. Las corrientes de convección causadas por las corrientes de aire y el movimiento de las extremidades del huésped pueden reducir los vapores sobre la piel expuesta18. Los compuestos repelentes con alto punto de ebullición no son adecuados para la preparación de formulaciones tópicas debido a su insuficiente tasa de evaporación, mientras que los componentes con bajo punto de ebullición se disipan rápida y fácilmente21. N,N-Dietil-3-metilbenzamida (DEET), N,N-dietil fenilacetamida (DEPA), ftalato de dimetilo (DMP), N,N-dietil benzamida (DEBA) y aletrina, se utilizan en la mayoría de los mosquitos comerciales. formulaciones repelentes11,22, que son sustancias químicas sintéticas persistentes y no biodegradables23. Su mayor exposición al medio ambiente puede perjudicar el ecosistema23,24,25. DEET puede disolver plástico en anteojos, relojes de pulsera, etc.; tener un olor fuerte, creando sensaciones aceitosas y de ardor, e incluso puede causar molestias, especialmente cuando se aplica en dosis más altas26. Además, los problemas emergentes relacionados con el desarrollo de resistencia, los efectos secundarios, la toxicidad para organismos no objetivo y las preocupaciones ecológicas, entre estos agentes repelentes sintéticos, están causando serias preocupaciones27. Los usuarios, por lo tanto, prefieren repelentes que contengan activos alternativos28.

Los aceites esenciales de hierbas (AE) tienen diversos componentes químicos, que poseen propiedades insecticidas, repelentes y disuasorias29. Varias composiciones químicas presentes en los aceites esenciales contribuyen a la eficacia de las formulaciones tópicas de repelentes de mosquitos. Los estudios sugieren que los aceites esenciales podrían ser casi tan efectivos como el DEET29,30,31. El Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos recomienda el aceite de limón y eucalipto como alternativa al DEET por su eficacia contra insectos32. Organismos internacionales como la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de los Estados Unidos (US) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), así como otros países aprobaron varios OE para su uso diversificado en cuanto a su accesibilidad, disponibilidad, confiabilidad, economía y bajo costo. evaluación de riesgos con química compleja y no están sujetos a requisitos de registro federal27,33. Numerosos productos naturales a base de EO se utilizan como repelentes de insectos. Sin embargo, los productos vegetales han sido registrados como repelentes de insectos tópicos seguros y efectivos34, pero su alergenicidad, mutagenicidad, genotoxicidad y tiempo de protección completa aún son cuestionables. La investigación exhaustiva sobre la formulación tópica repelente de mosquitos eficaz, segura y respetuosa con el medio ambiente para la protección al aire libre con un tiempo de protección prolongado se ha ido incrementando gradualmente35. Por lo tanto, en la presente investigación, examinamos catorce EO por su actividad repelente contra los mosquitos Aedes albopictus, y desarrollamos una formulación de crema repelente de mosquitos de mayor duración (EO-MRC) basada en EO utilizando la mejor combinación de EO, a saber. aceite de citronela, aceite de clavo y aceite de limoncillo. Se llevó a cabo un estudio de caracterización, eficacia, seguridad y toxicidad del EO-MRC con un estudio de acoplamiento molecular de Silico para resumir la afinidad de unión de los componentes del EO al sitio objetivo. También estudiamos la expresión del anticuerpo Anti-OBP2A y TRPV1 en la parte de la cabeza de un mosquito mediante transferencia de Western, que podría desempeñar un papel importante en la repulsión de mosquitos de la piel expuesta de un huésped. En resumen, el objetivo principal de nuestro estudio es desarrollar y caracterizar una formulación de crema tópica a base de EO para repelente de mosquitos con toxicidad reducida para protección al aire libre.

El porcentaje de repelencia de mosquitos de catorce AE reveló su eficacia contra Aedes albopictus (Ae. Albopictus). Sin embargo, la máxima respuesta fue evidente con aceite de citronela (95,83 %), aceite de clavo (91,66 %), aceite de lavanda (86,95 %) y aceite de limoncillo (95,83 %), bajo el bioensayo del módulo K&D. El aceite de hierba de limón y el aceite de citronela exhibieron la máxima repelencia, mientras que el aceite de albahaca provocó la menor repelencia (29,16%). En este estudio, los cuatro mejores aceites entre los catorce aceites esenciales se evaluaron más a fondo por su efecto sinérgico contra los mosquitos bajo el módulo K&D. La mezcla de aceite de clavo, aceite de citronela y aceite de hierba de limón mostró una propiedad de repelencia máxima (96 %), mientras que la mezcla de aceite de hierba de limón, aceite de lavanda y aceite de clavo mostró la menor respuesta (80 %). El porcentaje de repelencia para diferentes concentraciones de catorce EO y mezclas de los mejores aceites junto con su ED50 y ED95 se muestran en la Tabla 1.

La compatibilidad química de los EO y los excipientes que se utilizarán en EO-MRC se evaluó mediante espectroscopia FT-IR. Los espectros FT-IR de los analitos se presentan en la figura complementaria S1, respectivamente.

El aceite de citronela mostró un pico característico a 791/cm, 1380/cm y 1460/cm para la flexión C-H, lo que podría deberse a la presencia de grupos alcano y aldehído disustituidos en 1,2. Un pico a 1260/cm podría deberse a la presencia de alquil aril éter, otro pico a 1666/cm y 1714/cm podría deberse a la presencia de éster α, β-insaturado, cetona conjugada. El pico a 1844/cm y 2908/cm puede deberse a la presencia de alcano y otro pico característico a 3425/cm corresponde al grupo alcohólico. Un pico a 990/cm para flexión C=C; 1260/cm para estiramiento C–O; 1714/cm y 1666/cm para estiramiento C=O; 2844/cm y 2908/cm estiramiento C-H; 3425/cm para estiramiento O–H respectivamente.

El aceite de clavo mostró un pico de 752/cm para la flexión C-H; 1308/cm para estiramiento S=O; 1714/cm para estiramiento C=O; 2932/cm para estiramiento C-H; 3472/cm para estiramiento O–H respectivamente.

El aceite de hierba de limón mostró un pico de 791/cm para la flexión C-H; 1030/cm para estiramiento S=O; 1284/cm para estiramiento S=O; 1515/cm estiramiento N–O; 1610/cm para estiramiento C=C; 1746/cm para estiramiento C=O; 2932/cm para el estiramiento C-H respectivamente.

El miristato de glicerol mostró un pico a 728/cm y 1465/cm ​​para la flexión C-H; 1181/cm para estiramiento C–O; 1730/cm para estiramiento C=O; 2844/cm y 2940/cm para estiramiento C-H 3322/cm para estiramiento N-H respectivamente.

El alcohol cetílico mostró un pico pronunciado a 735/cm y 1465/cm ​​para la flexión CH; 1069/cm para el alargamiento C–O, que podría deberse a la presencia de alcohol primario; 2836/cm y 2908/cm para el estiramiento C–H, podría deberse a la presencia de alcano; 3234/cm para estiramiento O–H; 3337/cm para estiramiento N-H respectivamente.

El ácido esteárico mostró un pico a 754/cm para la flexión CH; 1284/cm para estiramiento C–O; 1730/cm para estiramiento C=O; 2971/cm para estiramiento C–H 3449/cm para estiramiento O–H respectivamente.

La vainillina mostró un pico a 735/cm para la flexión C-H, lo que podría deberse a algunos grupos funcionales monosustituidos; 1260/cm para el estiramiento C–O, podría deberse a la presencia de un grupo éster aromático; otro pico a 1515/cm de estiramiento N–O; 1595/cm y 1658/cm para estiramiento C=C; 3218/cm para estiramiento O–H respectivamente.

EDTA mostró un pico de 776/cm para la flexión C-H; 995/cm para flexión C=C; 1269/cm para estiramiento C–O; 1412/cm para estiramiento S=O; 1595/cm para flexión N–H; 3218/cm para estiramiento O–H respectivamente.

El metilparabeno mostró un pico a 960/cm para la flexión C=C; 1465/cm ​​para flexión C–H; 1730/cm para estiramiento C=O; 2916/cm y 3281/cm para el estiramiento C-H respectivamente.

El benzoato de sodio mostró un pico de 831/cm para la flexión C-H; 1061/cm para el alargamiento C–O, que podría deberse a la presencia de alcohol primario; 1412/cm para flexión O–H; 1547/cm para estiramiento N–O; 1603/cm para estiramiento C=C; 3027/cm y 3059/cm para estiramiento C-H; 3624/cm para estiramiento O–H respectivamente.

La parafina líquida ligera mostró un pico de 1388/cm para la flexión O–H; 1460/cm para flexión C–H; 2852/cm y 2955/cm de estiramiento C-H respectivamente.

El miristato de isopropilo mostró un pico a 1093/cm para el estiramiento C–O; 1380/cm para flexión O–H; 1467/cm para flexión C–H; 1738/cm para estiramiento C=O; 2860/cm y 2923/cm para estiramiento C-H; 3457/cm para estiramiento O-H respectivamente.

La dimeticona mostró un pico a 1061/cm para el estiramiento C–O; 1260/cm para estiramiento C–O; 1412/cm para flexión O–H; 1929/cm para flexión C–H; 2916/cm y 2971/cm para el estiramiento C-H respectivamente.

La vitamina E mostró un pico de 743/cm para la flexión C-H; 1770/cm para estiramiento C=O; 2868/cm para estiramiento C-H; 3504/cm para estiramiento O–H respectivamente.

El aceite de romero mostró un pico de 982/cm para flexión C=C 1465/cm ​​para flexión C-H 1750/cm para estiramiento C=O 2923/cm para estiramiento C-H respectivamente.

El polietilenglicol mostró un pico a 1308/cm para el estiramiento C-O; 1475/cm para flexión C–H; 1714/cm para estiramiento C=O 2844/cm y 2927/cm para estiramiento C–H respectivamente.

La interpolación 20 mostró un pico a 1117/cm para el estiramiento C–O; 1722/cm para estiramiento C=O; 2876/cm y 2916/cm para el estiramiento C-H respectivamente.

El glicerol mostró un pico a 1110/cm para el estiramiento C-O, lo que podría deberse a la presencia de alcohol secundario, y un pico característico a 1420/cm para el doblado O-H podría corresponder al grupo alcohólico respectivamente.

El propilparabeno mostró un pico a 960/cm para la flexión C=C; 1269/cm para estiramiento C–O; 1436/cm para flexión O–H; 1690/cm para estiramiento C=O; 1937/cm para flexión C-H 2964/cm para estiramiento C-H y pico a 3305/cm para estiramiento O-H respectivamente.

La mezcla física exhibió un pico a 1085/cm para el estiramiento C-O, lo que podría deberse a la presencia de alcohol primario; 1167/cm para el estiramiento C–O corresponde al grupo éster; 1603/cm para estiramiento C=C debido a la presencia de alqueno conjugado; 1722/cm para estiramiento C=O; 1921/cm para flexión C–H para compuestos aromáticos; 2852/cm y 2947 para estiramiento C-H; 3600/cm para el estiramiento O–H podría deberse a la presencia del grupo alcohólico respectivamente.

El estudio FT-IR confirmó la compatibilidad de los ingredientes de la formulación. Los picos de la mezcla física estaban intactos y correlacionados con los componentes individuales y no se observó interacción.

TGA investigó la estabilidad térmica del aceite de citronela, aceite de clavo, aceite de hierba de limón y su mezcla y los resultados se presentan en la figura complementaria S2. El aceite de citronela mostró una pérdida de masa del 98,09 % por debajo de los 300 ℃, lo que podría deberse a la descomposición del contenido orgánico de la muestra. El peso del aceite de clavo se mantuvo constante hasta 60 ℃ y comenzó la descomposición/pérdida de masa de 60 a 171,7 ℃. En la segunda región de pérdida de peso, de 171,7 a 599,6 ℃, el aceite de clavo dejó una masa residual de aproximadamente 0,87 %, respectivamente. El aceite de hierba de limón mostró una descomposición que oscila entre 60 y 228 ℃. La mezcla de aceite de citronela, clavo y limoncillo mostró una primera región de pérdida de peso de 30 a 260 ℃, respectivamente, donde todos los componentes de EO se descompusieron. Se mantuvo una masa residual de aproximadamente -16,18% a 599,6 °C en la segunda región de pérdida de peso (228–600 °C). El perfil TGA para EO-MRC mostró variaciones considerables en el comportamiento de pérdida de peso. Dentro de un rango de temperatura de 50 a 260 °C, podría ocurrir la eliminación de moléculas de EO cargadas con agua de bases de cremas repelentes. La segunda región de pérdida de peso se evidenció de 270 a 600 °C, lo que podría deberse a la descomposición de los excipientes utilizados para formular EO-MRC.

La optimización se realizó estableciendo los criterios para las funciones de deseabilidad en el software Design-Expert. El software generó un gráfico de superficie de respuesta tridimensional (Fig. 1) que es muy útil para estudiar los efectos de interacción de los factores en las respuestas. Los gráficos de superficie de respuesta describen el efecto de varios factores en la respuesta a la vez36. Aquí, la Fig. 1 indica el efecto de diferentes concentraciones de EO en el tiempo de protección completa (CPT) contra los mosquitos. La fórmula optimizada se basó en los criterios establecidos de tiempo máximo de protección. Por lo tanto, se prepararon diecisiete formulaciones de crema con los niveles predichos de factores de formulación. El modelo cuadrático no lineal generado por computadora fue:

donde, 'Y' fue el tiempo de protección completa (CPT), la variable de respuesta, asociada a cada combinación de nivel de factor; y aceite de citronela (A), aceite de limoncillo (B) y aceite de clavo (C) fueron los niveles codificados (en 2 niveles, nivel bajo y nivel alto) de las variables dependientes.

Gráfica de superficie de respuesta generada por software que muestra el efecto de las concentraciones de aceite esencial (X1, X2) en el tiempo máximo de protección (Y1). La optimización se realizó utilizando el software Design-Expert (Versión 6.0.8, Stat-Ease Inc., EE. UU., https://www.statease.com/software/design-expert/). La formulación óptima se basó en los criterios establecidos de tiempo máximo de protección. Donde, tiempo de protección completa CPT, aceite de clavo CLV, aceite de hierba de limón LMG, aceite de citronela CNL.

Las variables, junto con sus niveles, fueron seleccionadas con base en los resultados de la experimentación preliminar que se muestran en la Tabla 2. La matriz de diseño experimental para las cantidades de A, B y C, utilizada para preparar cada una de las diecisiete formulaciones generadas por el software y se observaron las respuestas. Se realizó ANOVA usando el mismo software para obtener la formulación más efectiva (Tabla 3). Se generaron nueve soluciones de formulación, siguiendo un diseño Box-Behnken (BBD) de 17 corridas, 3 factores y 3 niveles (Tabla 4). Se encontró que la mejor formulación de crema repelente de mosquitos a base de EO tiene las siguientes composiciones: 8,13 % de aceite de citronela, 4 % de aceite de clavo y 4 % de aceite de hierba de limón, y excipientes cs al 100 % (p/p), y la fórmula optimizada para 50 g de EO-MRC se muestran en la Tabla 5.

EO-MRC mostró resultados prometedores contra Ae. albopictus. El valor de CPT para EO-MRC se evaluó y comparó con DBMC. Los valores de repelencia se evaluaron utilizando el software IBM SPSS Statistics 21. Realización de la función de supervivencia de Kaplan-Meier. El CPT para EO-MRC y DBMC se determinó como 228 min y 285 min, respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 6 y la Fig. 2.

Gráfica acumulativa de supervivencia frente a tiempo contra EO-MRC y DBMC para determinar el tiempo de protección completo (CPT). El valor de CPT se evaluó para la crema comercializada basada en EO-MRC y DEBA (DBMC). Los datos se evaluaron con el software IBM SPSS Statistics 21 (versión 21.0, 1 New Orchard Road, Armonk, New York 10504-1722, Estados Unidos, https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics-software). Realizando la función de supervivencia de Kaplan-Meier, se determinó el CPT para EO-MRC y DBMC.

Con base en el análisis GC-MS de los 14 OE, se identificaron varios componentes químicos, que se sabe que son los principales constituyentes químicos de esos aceites en particular (Tabla 7). Informamos los resultados de GC-MS para estos catorce EO en nuestro artículo de investigación anterior37. Composiciones químicas, a saber, careno, cariofileno, citral, d-limoneno, aceite de betulla, canfeno, carveol, cinamaldehído, cariofileno, citronelal, citronelol, limoneno, eugenol, geraniol, isoneral, linalol, longifoleno, l-4-terpeneol y α- terpineol fueron identificados por GC-MS. Aquí, llevamos a cabo el acoplamiento molecular para centrarnos en la afinidad de unión de estas sustancias químicas (ligandos) con las proteínas antenales del mosquito, lo que podría ser el primer informe sobre esta área de estudio.

Se construyeron curvas de calibración de cuatro puntos (concentraciones) para eugenol y citronelol (Fig. S3 complementaria). Se encontró que el porcentaje de ensayo de eugenol y citronelol en EO-MRC era 60,59% y 55,08%, respectivamente. El cromatograma GC-MS de EO-MRC se muestra en la Fig. 3. Diferentes componentes químicos de EO, a saber, careno, canfeno, o-cimeno, d-limoneno, eucaliptol, linalool, citronelal, isoneral, isoborneol, l-alfa-terpineol , citronelol, citral, geraniol, eugenol, cariofileno, miristato de isopropilo se identificaron en EO-MRC.

cromatograma GC-MS de EO-MRC; donde, 1: 3-careno; 2: canfeno; 3: o-cimeno; 4: d-limoneno; 5: eucaliptol; 6: linalool; 7: citronelal; 8: isoneral; 9: isoborneol; 10: l-alfa-terpineol; 11: citronelol; 12: citral; 13: geraniol; 14: citral; 15: eugenol; 16: cariofileno; 17: miristato de isopropilo; 18: 1-hexadecanol; 19: 1-hexadecanol.

Se prepararon formulaciones de EO-MRC y placebo para obtener una emulsión de aceite en agua uniforme y estable con apariencia estética. EO-MRC mostró una buena uniformidad y capacidad de esparcimiento con olor y color aceptables. Se encontró que el pH de la formulación de EO-MRC y placebo era de 7,3 ± 0,08 y 6,93 ± 0,13 respectivamente. Los valores de densidad (1,02 ± 0,01 g/ml) y viscosidad (28 878,33 ± 594,99) indicaron una estabilidad suficiente de EO-MRC (los datos se muestran en la Tabla complementaria S1). Además, se requieren estudios sobre el efecto del almacenamiento a largo plazo para establecer la vida útil de las formulaciones.

Se observó un patrón decreciente de mortalidad de células epiteliales de pulmón humano (L-132) con concentraciones crecientes de EO-MRC, mientras que hubo una disminución notable en la viabilidad celular después de la exposición a las diferentes concentraciones de EO-MRC. La Figura 4 representa la viabilidad celular estimada, por ensayo MTT, para control (sin tratar) y 62 µg/mL, 125 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL y 1000 µg/mL, de formulación EO-MRC en cultivos L-132. Se evidenciaron concentraciones de 500 µg/mL y 1000 µg/mL con disminución significativa (p < 0.001) en la viabilidad celular, sin embargo, 250 µg/mL también inhibieron la viabilidad celular (p < 0.05) y concentración de EO-MRC de 62 µg/mL y 125 µg/ml no mostraron diferencias significativas en la viabilidad celular en comparación con las líneas celulares L-132 no tratadas. ANOVA seguido de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett, donde, NS = p > 0,05; *p ˂ 0.05; ***p˂ 0.001 respectivamente.

Histograma comparativo del estudio de viabilidad celular para EO-MRC a diferentes concentraciones de prueba. Se observó un patrón decreciente de mortalidad de la línea de células epiteliales de pulmón humano (L-132) con concentraciones crecientes de EO-MRC. Se evidenció concentración de EO-MRC de 500 y 1000 µg/mL con disminución significativa (p < 0.001) en la viabilidad celular. L-132 también fue inhibido significativamente (p < 0.05) por 250 µg/mL de EO-MRC, sin embargo, la concentración de 62 y 125 µg/mL no mostró diferencias significativas en la viabilidad celular en comparación con L no tratado o control -132 línea celular. ANOVA seguido de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett. Donde, NS = p > 0,05; *p < 0,05; *** p < 0,001.

En el estudio, no se observaron respuestas dérmicas adversas como eritema o edema después de un período de tratamiento de 72 h en los grupos de conejos tratados con placebo y EO-MRC. Sin embargo, los conejos del grupo de control positivo desarrollaron eritema severo así como edema después de 72 h de tratamiento. Se encontró que el valor PII de los grupos tratados con placebo y EO-MRC era 0, lo que indica la naturaleza no irritante de EO-MRC. El grupo de control positivo mostró un valor de PII de aproximadamente 5,16, lo que indica una irritación grave según las directrices estándar (los datos están disponibles en la Tabla complementaria S2).

No se observaron signos clínicos relacionados con el tratamiento durante el período de estudio. No había ningún eritema o edema, ni el área tratada de la piel estaba raspada. Las aberraciones en la actividad locomotora también estaban ausentes. El consumo diario de comida y agua era normal. Todas las ratas tenían un peso corporal normal y parecían activas y sanas. Las observaciones histopatológicas de la piel evidenciaron una arquitectura normal de la epidermis (ED), la dermis (D), la glándula sebácea (SG) y los folículos pilosos (HF) que se muestran en la Fig. 5a piel de control; Fig. 5b Piel tratada con EO-MRC. El tratamiento dérmico repetido de EO-MRC no causó ningún efecto adverso sobre el peso corporal y el consumo de alimento de los animales en comparación con el grupo de control. Se encontró que todos los animales estaban sanos durante todo el período de estudio.

Histopatología del tejido de la piel bajo estudio repetido de toxicidad dérmica para EO-MRC en ratas (a) piel de control; (b) Piel tratada con EO-MRC. No se observaron cambios notables en los tejidos cutáneos expuestos a EO-MRC en el estudio histopatológico. Histopatología del tejido branquial de D. rerio (c) branquia de control; ( d ) branquias expuestas EO-MRC; (e) branquias expuestas a deltametrina. Las branquias expuestas con EO-MRC muestran la misma arquitectura tisular que el grupo de control. El grupo expuesto a DLM (control negativo) muestra anomalías en la arquitectura del tejido. Flecha blanca: hiperplasia de base; IE: infiltración de eritrocitos; EL: levantamiento epitelial.

A partir de un estudio de irritación ocular aguda en conejos, nuestros resultados clasifican al EO-MRC como no irritante (Fig. 6). Sin embargo, la capsaicina (grupo de control negativo), como un irritante conocido especialmente utilizado en la utilización de defensa, se clasificó en la Categoría 2B (según el sistema UN-GHS), ya que las respuestas de irritación se observaron dentro de las 48 h.

Estudio de irritación ocular aguda en ojos de conejo después de 1 h, 24 h y 48 h de grupos expuestos de control (sin tratar), EO-MRC, capsaicina (control negativo). La capsaicina se usó aquí como un irritante conocido, especialmente usado en la capsigranada bajo utilización de defensa, perteneciente a la Categoría 2B, como la reversibilidad de las respuestas animales. El grupo expuesto a EO-MRC no resultó irritante para los tejidos oculares.

Las modificaciones patológicas más frecuentes fueron el levantamiento epitelial, la infiltración de eritrocitos y la hiperplasia básica. Bajo todos los cambios morfológicos observados, la deltametrina (DLM) mostró efectos más severos en la estructura branquial. Se observó una toxicidad mínima para los tejidos branquiales en el grupo expuesto a EO-MRC y se evidenció con infiltración de eritrocitos e hiperplasia de la base. Los resultados se muestran en la Fig. 5c branquias de control; Fig. 5d Branquia expuesta con EO-MRC; Fig. 5e branquias expuestas a deltametrina.

Las enzimas AChE están ubicadas en la hendidura sináptica que hidrolizan el neurotransmisor acetilcolina (ACh) a acetato y colina y terminan la transmisión sináptica. Los cambios en la actividad de AChE pueden resultar de la exposición a ciertos químicos o insecticidas, que actúan como inhibidores de la colinesterasa. A partir de los valores que se muestran en la Fig. 7a, quedó claro que el nivel de actividad de AChE disminuyó (83 ± 15 unidades) significativamente (p < 0,01) en ratas expuestas a transflutrina (TNSF) en comparación con el control (177 ± 28 unidades) respectivamente. En ratas expuestas a EO-MRC, no se registró una disminución significativa (p > 0,05) en AChE y se encontró que el valor era de 132 ± 13 unidades respectivamente. ANOVA seguido de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett. Donde, NS = p > 0,05; ** p < 0,01.

El cambio en la actividad de la AChE puede deberse a la exposición a ciertos químicos o insecticidas, que actúan como inhibidores de la colinesterasa. La mayoría de los componentes de EO se han informado como inhibidores de AChE. ( a ) ensayo de actividad de AChE en ratas wistar después de la exposición a TNSF y EO-MRC; Se observó una disminución significativa (p < 0,01) de AChE en el grupo expuesto a TNSF. El grupo expuesto a EO-MRC no mostró diferencias significativas (p > 0,05) en las concentraciones de AChE en comparación con el grupo de control; ( b ) niveles de expresión relativos de TRPV1 y Anti-OBP2A, en la parte de la cabeza del mosquito después de la exposición a TNSF y EO-MRC según lo cuantificado por ImageJ. Se observó una sobreexpresión significativa (p < 0,01) de anti-OBP2A en la parte de la cabeza del mosquito expuesta a EO-MRV (13,02 ± 2,05) pero, en el caso del grupo expuesto a TNSF, el nivel de expresión se inhibió (p > 0,05). Los mosquitos expuestos a EO-MRC mostraron niveles de expresión similares a los del mosquito de control (p > 0,05). También se ha registrado un patrón de expresión similar para TRPV1 (p > 0,05). La expresión de TRPV1 fue menor en los mosquitos expuestos a TNSF en comparación con el control (p > 0,05). Pero, en el caso de los mosquitos expuestos a EO-MRV, se observó una mayor expresión de TRPV1; sin embargo, no se registró ningún cambio significativo (p > 0,05) en el grupo de mosquitos expuestos a EO-MRC en comparación con el control. ANOVA seguido de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett. Donde, NS = p > 0,05; ** p < 0,01. Las transferencias/geles originales se presentan en las Figs. complementarias. S9–Figs. S11.

Las concentraciones de proteína obtenidas para EO-MRV, EO-MRC, TNSF y mosquitos de control fueron 7,14 mg/ml, 3,03 mg/ml, 9,146 mg/ml y 3,275 mg/ml, respectivamente. Sobre la base de estas concentraciones, se calculó la cantidad de cada muestra de tratamiento que contenía 50 μg de proteína y se cargó en los respectivos geles SDS PAGE. Por lo tanto, en base a las concentraciones antes mencionadas, se cargaron 6,68 μL, 16,4 μL, 5,46 μL y 15,26 μL de EO-MRV, EO-MRC, TNSF y muestras de control para SDS PAGE respectivamente.

Los niveles de expresión relativos de TRPV1 y Anti-OBP2A, cuantificados por ImageJ, se muestran en la Fig. 7b. Como control, se experimentó con el gen doméstico, β-actina, antes de la transferencia de los otros anticuerpos y mostró una expresión profunda en la parte de la cabeza del mosquito. La expresión de anti-OBP2A se mostró en 22 kDa, mostró su mayor expresión (p < 0,01) en la parte de la cabeza del mosquito expuesta a EO-MRV (13,02 ± 2,05), pero en el caso del grupo expuesto a TNSF, el nivel de expresión se inhibió (3,37 ± 0,93). ), (p > 0,05). Los mosquitos expuestos a EO-MRC mostraron niveles de expresión similares (6,6 ± 1,5) a los del mosquito de control (6,62 ± 1,43), no se observaron diferencias significativas (p > 0,05). No se registraron cambios significativos (p > 0,05) en el grupo de mosquitos expuestos a EO-MRC para TRPV1 (2,9 ± 0,28) en comparación con el control. TRPV1 en la parte de la cabeza del mosquito mostró bandas con un peso molecular esperado de 100 kDa. En términos de intensidad de banda, WB mostró que la expresión de TRPV1 fue menor, sin embargo, no fue significativa (p> 0.05) en mosquitos expuestos a TNSF (2.07 ± 0.58) en comparación con las muestras de control (3.23 ± 0.88). Pero, en el caso de los mosquitos expuestos a EO-MRV, se registró una mayor expresión (p > 0,05) de TRPV1 (4,95 ± 1,44). ANOVA seguido de las pruebas de comparación múltiple de Dunnett. Donde, NS = p > 0,05; ** p < 0,01.

A partir de estudios de acoplamiento molecular, encontramos ocho compuestos, a saber, aceite de betula, cinamaldehído, citronelal, citronelol, estragol, eugenol, metil eugenol y o-cimeno, que mostraron una mejor tendencia a unirse con el sitio activo de las tres proteínas diana seleccionadas ( datos disponibles en la Tabla complementaria S3). Pero, en el caso de OBP de ambas especies de mosquitos (Aedes y Anopheles), el aceite de betula mostró mejores resultados con energía CDocker − 23,5487 kcal/mol y − 22,737 kcal/mol, respectivamente. Mientras que, en el caso de TRPV1 de ratas, el o-cimeno mostró los mejores resultados con energía CDocker − 19.981 kcal/mol. Las energías libres de unión de los mejores compuestos contra sus respectivos objetivos se muestran en la Tabla complementaria S4. Las interacciones de los tres compuestos contra sus respectivos objetivos se muestran en la Fig. 8, donde encontramos que el aceite de betula (salicilato de metilo) formó dos interacciones de enlaces de hidrógeno convencionales con Phe123 e Ile125; una interacción de enlace de hidrógeno de carbono con Leu124; seis interacciones hidrofóbicas (P-Pi Stacked, Alkyl y Pi-Alkyl) con Phe15, His111, Trp114, Tyr122 e Ile125. El aceite de Betula formó una interacción de enlace de hidrógeno convencional con Asn84; una interacción de enlace de hidrógeno de carbono con Tyr132; siete interacciones hidrofóbicas (Pi-Pi en forma de T, Amide-Pi apilado, Alkyl y Pi-Alkyl) con Leu72, Tyr73, Val79, Ala121, Ala124, Phe125 y Tyr132 con OBP de especies de Anopheles. O-Cymene formó dos interacciones hidrofóbicas con Leu553 e Ile569; y una interacción Pi-Anion con Glu570 de TRPV1 de ratas. Todos estos residuos de aminoácidos que interactúan son los componentes clave del sitio de unión activo informado de los objetivos seleccionados. Las interacciones de los compuestos restantes se proporcionaron en materiales complementarios (Figuras complementarias S5–Figuras S7).

Interacciones de aceite de betula (salicilato de metilo), cinamaldehído y eugenol contra. Proteínas de unión a olores (OBP) de Aedes (a), OBP de Anopheles (b) y proteínas TRPV1 de ratas (c). el aceite de betula formó dos interacciones de enlaces de hidrógeno convencionales con Phe123 e Ile125; una interacción de enlace de hidrógeno de carbono con Leu124; seis interacciones hidrofóbicas (P-Pi Stacked, Alkyl y Pi-Alkyl) con Phe15, His111, Trp114, Tyr122 e Ile125. O-Cymene formó dos interacciones hidrofóbicas con Leu553 e Ile569; y una interacción Pi-Anion con Glu570 de TRPV1 de ratas. Todos estos residuos de aminoácidos que interactúan son los componentes clave del sitio de unión activo informado de los objetivos seleccionados.

Los repelentes sintéticos siempre son problemáticos y tienen percepciones públicas negativas debido a sus efectos secundarios y toxicidad para los usuarios, así como efectos nocivos para la ecología y los organismos no objetivo38,39,40. Los AE son ricos en terpenoides y efectivos contra los mosquitos por su propiedad insecticida y repelente. Son económicos, seguros, fácilmente disponibles, menos tóxicos y disminuyen las posibilidades de resistencia a los insectos debido a su química compleja. En nuestra investigación anterior, informamos el ensayo de atracción y repelencia de catorce AE contra Musca domestica usando un olfatómetro de tubo en 'Y'. La mezcla de aceite de clavo, citronela y limoncillo exhibió la máxima respuesta de orientación de vuelo. En este estudio también, la mezcla de aceite de citronela, clavo y hierba de limón mostró los mejores resultados contra los mosquitos en el estudio K&D. La eficacia del AE depende de los diferentes fitoconstituyentes presentes en cada aceite.

Bajo la caracterización, el estudio FT-IR confirmó que los aceites esenciales y otros ingredientes auxiliares de la formulación son compatibles entre sí y que los picos de la mezcla física están intactos y correlacionados con los productos químicos individuales. El termograma TGA mostró las tasas de pérdida de peso de los aceites esenciales en función de la elevación de la temperatura de 30 a 600 ℃. La pérdida de peso inicial del aceite de clavo se informó anteriormente de 80 a 90 ℃41. En nuestro estudio, EO-MRC mostró una primera región de pérdida de peso de 50 a 260 °C, lo que podría deberse a la eliminación de moléculas de EO cargadas con contenido de agua de las bases de crema repelente. La segunda región de pérdida de peso se evidenció de 270 a 600 °C, lo que podría deberse a la descomposición de los excipientes utilizados para formular EO-MRC. Un estudio similar fue realizado por Sattary et al.; preparó nanopartículas de sílice mesoporosa antifúngicas encapsuladas con aceite de hierba de limón y aceite de clavo contra la enfermedad global del trigo42. GC-MS se utilizó para la identificación de las composiciones químicas presentes en Eos y también para evaluar el ensayo de eugenol y citronelol presentes en EO-MRC. Para la identificación y cuantificación de compuestos volátiles y semivolátiles, la GC-MS proporcionó un alto rendimiento y una alta sensibilidad de los resultados analíticos43.

La función de supervivencia de Kaplan-Meier fue utilizada previamente por Gray et al .; para determinar la mortalidad diaria de Ae resistente a los piretroides. aegypti por cada día de exposición posterior al insecticida44. Para medir la fracción de sujetos que viven o sobreviven o están protegidos después del tratamiento, la estimación de Kaplan-Meier es una de las mejores opciones que se pueden utilizar45. En este estudio, se llevó a cabo un bioensayo de mosquitos para determinar el CPT según las pautas de prueba estándar recomendadas por la OMS46. La eficacia de los AE ha sido reportada previamente por Azeem et al.47. Revelaron más de 45 min de tiempo de protección debajo del brazo en el bioensayo de jaula47. Los resultados de nuestro estudio confirman que, después de procesar la mejor combinación de aceites esenciales en formulaciones, el producto desarrollado brindó una protección completa de hasta 228 min, respectivamente.

Las moléculas lipofílicas presentes en los aceites esenciales pueden entrar directamente en las células pulmonares del usuario, ya que solo hay una membrana celular que atravesar. Por lo cual, el efecto de respirar fragancias de EO de EO-MRC puede ser considerable. Puede haber posibilidades de toxicidad para los pulmones debido al uso excesivo de EO, pero la concentración real no se ha calculado y hay muy pocos estudios disponibles48. La Asociación de Fabricantes de Saborizantes y Extractos (FEMA) otorgó el estatus de generalmente reconocido como seguro (GRAS) a la mayoría de los EO y están aprobados por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA de los EE. UU.) para su uso en alimentos, cosméticos y productos farmacéuticos. Después de realizar una evaluación por parte del panel de expertos de FEMA, esto fue revisado en 1996. Básicamente, la mayoría de los ingredientes de sabor a menos de 100 ppm se pueden usar para la exposición, y se pueden evaluar las predicciones sobre su seguridad49. Por lo tanto, a partir de los resultados de nuestro estudio sobre L-132, EO-MRC podría considerarse apropiado como repelente de mosquitos efectivo sin producir ningún efecto dañino para las células pulmonares.

La determinación del estudio de irritación dérmica aguda es útil cuando la formulación va a estar expuesta en la piel. Proporciona información sobre los peligros para la salud que probablemente surjan de una exposición a corto plazo por vía dérmica50. El estudio de irritación dérmica aguda de EO-MRC en conejos y el estudio de toxicidad dérmica de dosis repetidas en ratas Wistar confirman que EO-MRC es seguro y no produce efectos nocivos para la piel. Bajo un estudio de irritación ocular aguda, EO-MRC demostró su naturaleza no irritante para los tejidos oculares. Una sustancia de prueba se clasifica como irritante ocular de categoría 2A del Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos de las Naciones Unidas (UN GHS) cuando muestra una respuesta positiva de enrojecimiento conjuntival ≥ 2; edema conjuntival ≥ 2 opacidad corneal ≥ 1; iritis ≥ 1; estimado como las puntuaciones medias después de graduar en diferentes intervalos de tiempo como 24 h, 48 h y 72 h después de la instilación de la sustancia de prueba, y que se invierte por completo dentro de un tiempo de observación de 21 días. Si los efectos antes mencionados son completamente reversibles dentro de un tiempo de observación de 7 días, entonces la sustancia de prueba se clasificaría en la categoría 2B51.

Los piretroides y organofosforados sintéticos se están convirtiendo en una amenaza para los peces y otros animales acuáticos52. Hedayati et al. informaron datos hematológicos y de histopatología de branquias en tiburones iridiscentes (Pangasius hypophthalmus) expuestos a insecticidas organofosforados y piretroides53. En nuestro estudio, la toxicidad no diana en D. rerio confirma la naturaleza no tóxica de EO-MRC. Aquí también se usó DLM como control negativo. Se encontró que la histopatología de branquias de pescado de EO-MRC era la misma arquitectura tisular que las branquias no tratadas (control). Nuestro hallazgo en las branquias de D. rerio tiene resultados similares a los informados previamente en la histopatología de las branquias de los peces.

Se determinó una disminución de AChE en el cerebro de ratas expuestas a TNSF, lo que podría estar asociado con un aumento en la peroxidación de lípidos54 y la posibilidad de interrupción de las actividades metabólicas y nerviosas55. Sin embargo, las ratas expuestas a EO-MRC no mostraron ninguna diferencia significativa con las ratas de control. El aumento de la actividad de AChE provoca una disminución de la cantidad de ACh, lo que provoca una reducción del flujo sanguíneo y vasodilatación56. En la hipoperfusión cerebral por ligadura de las arterias carótidas comunes, la reducción de ACh en el área del hipocampo es responsable del deterioro de la memoria y el aprendizaje57. En diversos estudios de investigación se ha reportado la pérdida de terminales colinérgicos perivasculares en pacientes con enfermedad de Alzheimer58,59. Además, se sabe que la medicación inhibidora de la AChE afecta la función colinérgica en sujetos tratados con hipoxia hipobárica (↓actividad de la AChE, ↑niveles de la ACh y aumento de la colina acetiltransferasa, enzima que tiene un papel en la formación de la ACh) y, finalmente, la función de la memoria60.

Las proteínas de unión a olores (OBP) son el primer relé en la recepción semiquímica en insectos, ya que son el enlace entre el medio aéreo que transmite señales químicas y los receptores de olores que se encuentran en las estructuras olfativas (principalmente la antena y las pulpas maxilares) de la periferia de los insectos. sistema sensorial 61. No se ha observado una expresión significativa de OBP-2A en la parte de la cabeza de ratas expuestas a EO-MRC; sin embargo, los mosquitos expuestos a EO-MRV, que contenían los mismos EO, mostraron una sobreexpresión de OBP-2A. Podría deberse al patrón de exposición de EO a los grupos objetivo. Confirma que los EO tienen la capacidad de sobreexpresar la OBP de los mosquitos. En el caso de la parte de la cabeza del mosquito expuesta al TNSF sintético, se inhibió la OBP-2A. En el caso de TRPV1, la parte de la cabeza del mosquito expuesta a EO-MRV mostró una sobreexpresión de esta proteína, mientras que el grupo expuesto a EO-MRC no mostró ningún cambio y el grupo expuesto a TNSF mostró inhibición de TRPV1, respectivamente. Esto podría ser una indicación de que TRPV1 se expresa más en los tejidos inflamados, lo que asocia su importancia en la cascada inflamatoria antenal de los mosquitos. Se observaron los mismos resultados en el caso del anticuerpo anti-OBP2A también. Este es el primer informe que demuestra la expresión del anticuerpo TRPV1 y anti-OBP2A en la parte de la cabeza del mosquito. Los insectos utilizan al menos tres familias de receptores olfativos, a saber, receptores de olores (OR), receptores ionotrópicos (IR) y receptores gustativos (GR)12,62. DEET enmascara las neuronas receptoras olfativas (ORN) a los atrayentes y disminuye la sensibilidad al ácido láctico, un componente del sudor humano al disminuir la respuesta de las neuronas excitadas por el ácido láctico y aumentar la inhibición de las neuronas inhibidas por el ácido láctico12.

EO-MRC mostró resultados muy prometedores contra los mosquitos. El análisis de WB apoyó la expresión significativa de las proteínas diana cuando se trataron con una formulación desarrollada que contenía los aceites esenciales como ingredientes activos. Por lo tanto, en el estudio in-silico, intentamos averiguar las moléculas exactas presentes en los AE responsables de la actividad repelente. A partir del estudio de acoplamiento in silico, se identificaron ocho compuestos que mostraron una mejor afinidad para unirse a las proteínas diana de las especies de mosquitos y ratas para formar un complejo proteína-ligando estable. El estudio in silico reveló que los ocho compuestos identificados de los aceites esenciales desempeñan un papel importante en la propiedad general de repelencia del producto desarrollado.

AE de albahaca (Ocimum basilicum L.), bergamota (Citrus bergamia Risso & Poit), alcanfor [Cinnamomum camphora (L.) J. Presl.], canela (Cinnamomum zeylanicum Blume), citronela [Cymbopogon nardus (L.) Rendle] , clavo (Eugenia caryophyllus Wight), eucalipto (Eucalyptus globulus Labill.), jazmín (Jasminum officinale L.), lavanda (Lavandula angustifolia Mill.), limoncillo [Cymbopogan citratus (DC.) Stapf], menta (Mentha piperita L. ), romero (Rosmarinus officinalis L.), pachulí (Pogostemon patchouli Benth) y cúrcuma silvestre (Curcuma aromatica Salisb.) se obtuvieron de Talent Technologies (Talent Technologies, Kanpur, India). El kit de ensayo de actividad de acetilcolinesterasa (AChE), el anticuerpo anti-OBP2A, los kits ELISA, 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) y solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirieron de Sigma Aldrich (Sigma Aldrich Chemical Co., San Luis, EE. UU.). El anticuerpo TRPV1 se adquirió de Santa Cruz (Santa Cruz, California, EE. UU.). El 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) se adquirió de Cayman (Cayman Chemical Company, Michigan, EE. UU.). La línea celular de pulmón humano normal (L-132) se obtuvo del Centro Nacional de Ciencias Celulares (NCCS), Pune, India. La acetona de grado de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se adquirió de Merck (Merck Pvt. Ltd., Mumbai, India). Todos los demás productos químicos utilizados eran del grado analítico más alto disponible.

Hembra adulta de 5 a 7 días de edad Ae. Los mosquitos albopictus se alojaron en el insectario de laboratorio, División de Tecnología Farmacéutica, Laboratorio de Investigación de Defensa, Tezpur, Assam, India. Los mosquitos se criaron manteniendo temperatura a 27 ± 2 °C, humedad relativa: 75 ± 5% HR y 14L:10D h de ciclos alternativos de luz-oscuridad en jaulas de madera de tamaño estándar (75 cm × 60 cm × 60 cm) con un abertura de la manga en un lado como se describió anteriormente63. Se proporcionó una solución de sacarosa al 10% ad libitum para la alimentación. Antes de la prueba, los mosquitos se privaron de alimento durante 24 h.

Se realizó un estudio de respuesta a la dosis para evaluar los mejores aceites entre los catorce AE. Este estudio fue aprobado (número de aprobación: 032/2021TMCH, 28/08/2018) por el Comité Institucional de Ética Humana (IHEC), del Tezpur Medical College & Hospital (TMCH), Tezpur, Assam, India, y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se eligen cinco voluntarios, no alérgicos a la picadura de mosquito y todos los voluntarios dieron su consentimiento informado por escrito. El muslo de un voluntario se marcó de acuerdo con el orificio de apertura de la puerta del módulo K&D según lo descrito por Klun y Debboun64. Está hecho de plexiglás y la base de la jaula rectangular (26 cm × 5 cm × 5 cm) tiene seis orificios, cada uno con orificios rectangulares de 3 × 4 cm que se abren y cierran mediante una puerta corrediza (Figura complementaria S8: Proporcione la fotografía del módulo K&D). La región flexora de los antebrazos de un voluntario humano se delineó con cuatro áreas de prueba rectangulares (3 cm × 4 cm). En las áreas marcadas se aplicó un volumen de 25 µL de cada concentración de los AEs en aceite de soya (40, 4 y 0.4 µg/cm2) y 25 µL del aceite de soya (diluyente) como control. Después de secar al aire durante 5 minutos, se colocó sobre las áreas tratadas un módulo K&D con cortes a juego en el piso, que contenía cinco mosquitos hembra nulíparas de 5 a 7 días de edad en cada orificio. Se abrieron las puertas de las celdas y se registró el número de mosquitos que picaban en cada celda dentro de una exposición de 2 min, después de lo cual se cerraron las puertas. Después de completar cada observación, los mosquitos se liberaron abriendo las celdas del módulo K&D en una jaula protegida con mangas. Para cada prueba, se utilizan grupos frescos de mosquitos. Se realizaron cinco repeticiones para cada ensayo. La eficacia de los AE se determinó por el porcentaje de repelencia contra mosquitos, utilizando la fórmula o Eq. (2) descrito por la OMS46.

donde, C es el número de mosquitos que aterrizan o pican en el área de control; T es el número de mosquitos que aterrizan o pican en el área tratada.

Es necesario un estudio de compatibilidad química para cada ingrediente de la formulación. Todos los ingredientes de la formulación poseen un valor específico de frecuencia vibratoria y tienen diversos grupos funcionales en sus estructuras químicas. Para el estudio de compatibilidad, cada AE, excipientes a utilizar en la formulación de la crema y su mezcla física se colocaron uno por uno sobre la placa de muestra del instrumento FT-IR (Bruker, ALPHA, Billerica, MA, EE. UU.). La sonda de cobertura se colocó sobre la muestra y se obtuvieron espectros IR en una longitud de onda de 2,5 a 25 μm a temperatura ambiente. Los grupos funcionales que posee cada ingrediente individual deben ser idénticos en su mezcla física, lo que confirma su compatibilidad37.

El comportamiento térmico del aceite de citronela, aceite de clavo, aceite de hierba de limón, su mezcla y EO-MRC se evaluó utilizando un analizador térmico (TG 209 F1 Libra®, NETZSCH-Gerätebau GmbH, 95100 Selb, Alemania). Se colocaron aproximadamente 10 mg de peso de muestra en el crisol cada vez. Se utilizó nitrógeno como gas de protección. El programa de calentamiento se fijó entre 30 y 600 °C a una velocidad de 10 °C/min.

Para la optimización, se utilizó un diseño Box-Behnken (BBD) de 17 ejecuciones, 3 factores y 3 niveles. Se construyó un modelo polinomial de segundo orden mediante la metodología de superficie de respuesta cuadrática (RSM) utilizando el software Design-Expert (Versión 6.0.8, Stat-Ease Inc., EE. UU.). Se obtuvieron un total de diecisiete formulaciones utilizando las concentraciones de EO como variables dependientes contra el tiempo de protección completa (CPT) como variable independiente o variable de respuesta. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) usando el mismo software para obtener la formulación más efectiva.

Se aplicó el método de temperatura de inversión de fase para la preparación de crema repelente de mosquitos a base de EO (EO-MRC). Se prepararon aproximadamente 50 g de muestra de crema para obtener suficiente para realizar los diversos ensayos cualitativos y cuantitativos. La fase oleosa (fase B) se preparó disolviendo los excipientes solubles en aceite, excepto la fase A (principios activos repelentes de mosquitos) bajo calentamiento suave a 200 rpm en un agitador de placa magnética caliente (Magnetic Stirrer IKA RCT basic) y calentado a 65 °C. . La fase acuosa se preparó mezclando varios ingredientes solubles en agua (fase C) con calentamiento y agitación suaves. La temperatura de la fase acuosa se elevó a 65 °C. La fase A se añadió suavemente a la fase oleosa a una velocidad de agitación de 200 rpm y 55 ± 2 °C. A continuación, la mezcla se emulsionó añadiendo lentamente la fase C y se mantuvo durante 1 h a una velocidad de agitación de 800 rpm y 60 ± 2 °C. A continuación, el EO-MRC formulado se mantuvo para enfriamiento natural.

El CPT de la formulación de crema desarrollada (EO-MRC) se llevó a cabo mediante un bioensayo de brazo en jaula. Se aplicó 1 ml de EO-MRC a un área de ≈ 600 cm2 de la piel del antebrazo entre la muñeca y el codo y se comparó 1 ml de la crema comercializada (DBMC) a base de N, N-dietil benzamida (DEBA) al 12 % en el otro brazo. . Dos jaulas de mosquitos (tamaño: 40 × 40 × 40 cm), cada una de las cuales contiene 200–250 hembras Ae. Se utilizaron albopictus. Una jaula está diseñada para probar el EO-MRC y la otra para el control positivo (DBMC). Durante las pruebas, las manos se protegieron con guantes quirúrgicos por los que los mosquitos no pueden picar mientras el voluntario evita el movimiento del brazo. Los brazos tratados con EO-MRC y DBMC se expusieron durante 3 min a intervalos de 30 min para determinar la actividad de aterrizaje y/o sondeo. Un solo aterrizaje o sondeo del mosquito dentro de un intervalo de prueba de 3 minutos concluye la prueba. El CPT se calculó como el tiempo (min) requerido para que el primer mosquito aterrizara o sondeara después de la aplicación del repelente en el área tratada. La mediana del CPT y los intervalos de confianza se estimaron a partir de la función de supervivencia de Kaplan-Meier46.

La eficacia se correlacionó con la crema comercializada a base de DEBA (DBMC). La inclusión del producto comercial específico DBMC es para comparación y no constituye ninguna recomendación.

Se identificaron diferentes componentes químicos en catorce OE y la mezcla seleccionada mediante un sistema GC-MS de Agilent Technologies (5301 Stevens Creek Blvd. Santa Clara, CA 95051, Estados Unidos). Se preparó una concentración de muestra de prueba de 500 μg/mL en acetona de grado GC. Se introdujo un volumen de muestra de 1 μL en el inyector mantenido a 250 °C. La temperatura del horno de 40–300 °C se programó a 20 °C/min. Se utilizó helio como gas portador a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La temperatura del inyector y del detector se fijó en 250 °C y 230 °C (quad) y 150 °C (núcleo) respectivamente37. Los alcanos saturados C7-C30 estándar se adquirieron de Sigma Aldrich Chemicals Co., St. Louis, EE. UU. Se determinaron los índices de retención (RI) de los componentes identificados para la identificación de los componentes detectados.

Las muestras de calibración de eugenol y citronelol se prepararon disolviendo una cantidad apropiada en acetona de grado GC para obtener concentraciones de 62,5 μg/mL, 125 μg/mL, 250 μg/mL y 500 μg/mL. Se prepararon muestras de prueba de EO-MRC, aceite de clavo y aceite de citronela disolviendo una cantidad requerida en acetona para cuantificar los componentes de EO en la formulación final. Se introdujo un volumen de muestra de 1 μL en el inyector como se describe en la sección "Estudio cualitativo".

Se determinaron los parámetros físicos de las formulaciones de EO-MRC y placebo para establecer el cumplimiento estético y la aceptabilidad del consumidor. Para determinar la viscosidad se utilizó un viscosímetro programable (Modelo: DV2T, Ametek Brookfield, Middleboro, MA, USA); combinado con el software Rheo3000, versión 1.2.2019.1 [R]. El volumen de la muestra se fijó en 30 gy las viscosidades se determinaron a 10 rpm durante 40 s a temperatura ambiente utilizando un husillo T-Bar (B-92) (juego de husillos Helipath, Brookfield Engineering Labs. Inc). La densidad se determinó utilizando un picnómetro. El pH de EO-MRC se comprobó utilizando un medidor de pH digital (Labman Scientific Instruments, Tamil Nadu, India).

La capacidad de propagación de EO-MRC se determinó según el método informado anteriormente por Sabale65. En resumen, se colocó 1 g de EO-MRC en un área circular premarcada de 1 cm2 en el portaobjetos de vidrio (7,5 cm × 2,5 cm). El EO-MRC se comprimió usando otro portaobjetos de vidrio colocado desde el borde hasta el centro del portaobjetos principal. Se colocaron 200 g de peso comercial sobre el montaje y se dejó esparcir el gel por el lapso de 1 min. El diámetro de dispersión se calculó con la ayuda de papel cuadriculado y la capacidad de dispersión se evaluó utilizando la fórmula expresada como Eq. (3):

donde, m es el peso comercial colocado en la instalación; l es la longitud de la crema para untar; y t es el tiempo.

La reducción de sales de tetrazolio ahora se acepta ampliamente como una forma confiable de examinar la proliferación celular. El tetrazolio amarillo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio) es reducido por células metabólicamente activas, en parte por la acción de enzimas deshidrogenasas, para generar equivalentes reductores como NADH y NADPH. Con la ayuda de medios espectrofotométricos, se puede cuantificar el formazán púrpura intracelular resultante. El ensayo mide la tasa de proliferación celular y, por el contrario, cuando los eventos metabólicos provocan apoptosis o necrosis, la reducción de la viabilidad celular66.

Las células cultivadas en matraces T-25 se tripsinizaron y aspiraron en un tubo de centrífuga de 5 ml. El sedimento celular se obtuvo por centrifugación a 3000 rpm. El recuento de células se ajustó utilizando medio DMEM HG, de modo que 200 μL de suspensión contenían aproximadamente 10.000 células. A cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos, se añadieron 200 μL de la suspensión celular y la placa se incubó a 37 ℃ y una atmósfera de CO2 al 5 % durante 24 h. Después de 24 h, se aspiró el medio gastado. 200 μL de diferentes concentraciones de prueba a saber. Se añadieron 62 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml y 1000 µg/ml de EO-MRC a los pocillos respectivos. A continuación, la placa se incubó a 37 °C y una atmósfera de CO2 al 5 % durante 24 h. Se retiró la placa de la incubadora y se aspiró el medio que contenía el fármaco. Luego se agregaron 200 μL de medio que contenía reactivo MTT al 10 % a cada pocillo para obtener una concentración final de 0,5 mg/mL y la placa se incubó a 37 ℃ y una atmósfera de CO2 al 5 % durante 3 h. Sin alterar los cristales formados en los pocillos, se eliminó completamente el medio de cultivo. Se añadieron 100 μl de solución de solubilización (DMSO) a cada pocillo y luego se agitó suavemente la placa en un agitador oscilante (ROCKYMAX™, Tarsons, Kolkata, India) para solubilizar el formazán formado. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 570 nm y también a 630 nm utilizando un lector de microplacas. Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento y se generó la concentración de EO-MRC necesaria para inhibir el crecimiento celular en un 50% (IC50) a partir de la curva de dosis-respuesta para la línea celular.

Todos los protocolos de experimentación con animales se realizaron de acuerdo con los "Principios del cuidado de animales de laboratorio" (publicación NIH 85-23, revisada en 1985) y aprobados por el Comité Ético Animal Institucional (IAEC) del Laboratorio de Investigación de Defensa (DRL), Tezpur, Assam, India (aprobación n.° CPCSEA/DRL/Protocolo n.° 3, 20/06/2018). Todos los estudios que involucran animales se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE para informar experimentos con animales67. Se hicieron todos los esfuerzos durante el período de estudio para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados.

De 5 a 8 semanas de edad, se obtuvieron alrededor de 210 a 250 g de ratas Wistar adultas sanas (Rattus norvegicus) y conejos albinos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus) jóvenes y sanos de la instalación institucional de alojamiento de animales y se les permitió aclimatarse durante 7 días antes de el estudio. Se proporcionaron alimentos estándar y agua purificada ad libitum en condiciones limpias e higiénicas a 22–25 ℃, 40–70 % de HR con ciclos de luz y oscuridad de 12 h.

Se realizó un estudio de irritación dérmica aguda en conejos albinos sanos de Nueva Zelanda siguiendo las directrices de prueba 40468 de la OCDE. Aproximadamente 24 h antes de la prueba, se eliminó el pelaje de la zona dorsal del tronco. 0,5 g de EO-MRC, se aplicó directamente sobre la piel y después de un período de exposición de 4 h, el EO-MRC residual se eliminó usando agua sin perturbar la integridad de la epidermis y se examinó en busca de signos de eritema y edema, a los 60 min, y luego a las 24 h, 48 h y 72 h después de la eliminación de EO-MRC. Las reacciones dérmicas se clasifican y registran según los grados de la Tabla 8. Según el método descrito por Banerjee et al.69; Se calculó el índice de irritación primaria (PII). Además, hemos seguido el método Draize de clasificación para la puntuación de PII como no irritante (si PII < 0,5), levemente irritante (si PII < 2), moderadamente irritante (si PII ≤ 2–5) y muy irritante (si PII > 5)70 y luego se calculó la puntuación media de irritación por punto de tiempo. Luego se sumaron las puntuaciones medias en el día 1, día 2 y día 3 y se siguió la ecuación para obtener el PII.

donde, Xa es la puntuación media de formación de eritema; Xb es la puntuación media de formación de edema; \(t\_1\) es el día 1; \(t\_2\) es el día 2; \(t\_3\) es el día 3.

Según la directriz de la OCDE 41071, la toxicidad dérmica de dosis repetidas del EO-MRC se llevó a cabo durante un período de 21 días. Se alojaron ratas Wistar sanas en 2 grupos diferentes (control y tratadas con EO-MRC) y cada grupo contenía 06 animales después de la aclimatación inicial durante al menos 5 días antes del estudio. Brevemente, se eliminó el pelaje dorsal con una hoja de depilación de cirujano estéril (49-20 mm) y se trató un área dorsal de 4,0 × 4,0 con placebo y sustancias de prueba durante al menos 6 h/día, 5 días a la semana, durante 21 días. . Diariamente se monitoreó una observación con respecto al peso corporal y el consumo de alimento72.

Para este experimento, se llevó a cabo el procedimiento de ensayo de irritación ocular aguda OECD TG 405 en conejos jóvenes y sanos50. Se colocaron 50 mg de EO-MRC en el saco conjuntival durante 5 s tirando suavemente del párpado inferior del globo ocular derecho; donde, el ojo izquierdo sirvió como control. Como control negativo se utilizó capsaicina, un irritante ocular. El ojo del animal no se lavó durante las siguientes 24 h después de la instalación de capsaicina. Las observaciones de cualquier lesión ocular a intervalos específicos de 1 h, 24 h y 48 h se evaluaron utilizando un microscopio con lámpara de hendidura (Haagstreit tipo AIA-11, Appaswamy)73.

La prueba de toxicidad aguda en Danio rerio (D. rerio) se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (Test no. 203, Acute Immobilization Test)74. Se expusieron siete D. rerio neonatos en cada recipiente de prueba y se analizaron tres réplicas, para un total de 21 D. rerio por grupo de tratamiento. Los individuos de D. rerio se colocaron en recipientes con 250 mL de agua pura, y se diluyó EO-MRC con acetona y se mezcló con el agua en las dosis correspondientes a las concentraciones de 200, 100 y 50 mg/L. El experimento se dividió en tres grupos. Los primeros dos grupos estuvieron formados por individuos de D. rerio, expuestos a la acción de EO-MRC y control negativo deltametrina (DLM) por un período de 24 h75. Los individuos de D. rerio del tercer grupo sirvieron como control.

Las condiciones físicas y químicas de los ensayos de toxicidad aguda fueron las siguientes: pH entre 7,2 y 7,6; temperatura constante de 25 ± 1 °C; conductividad eléctrica alrededor de 160 μS/cm; oxígeno disuelto por encima de 3 mg/L. Se contó el número de D. rerio muertas en las tres repeticiones y se usó para determinar la CL50 durante 24 h de exposición.

En este estudio, transfluthrin-1.6% (TNSF) y EO-MRC fueron expuestos a diferentes grupos de ratas (n = 6) durante 21 días. Los animales de control no recibieron exposición. Después de completar las 24 h desde la última exposición, todos los animales fueron sacrificados humanitariamente por dislocación cervical. Las muestras de tejido cerebral se recogieron y homogeneizaron utilizando tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,5, seguido de centrifugación a 14.000 rpm durante 5 min. Se usaron sobrenadantes aclarados para el ensayo, según el procedimiento descrito en el boletín técnico del kit de ensayo de actividad de acetilcolinesterasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 EE. UU.; número de catálogo: MAK119).

Parte de la cabeza de la hembra Ae. albopictus (n = 100 en cada grupo) previamente expuestos a EO-MRV (vaporizador repelente de mosquitos a base de aceite esencial), EO-MRC, TNSF y control (sin tratar) fueron aislados y recién homogeneizados en tampón RIPA y centrifugados a 12 000 rpm durante 15 min. Los sobrenadantes recolectados se mantuvieron a -80 °C para su posterior utilización. Según las instrucciones mencionadas en el protocolo de ensayo Biorad DC Protein (Bio-Rad, Hercules, CA), se determinaron las concentraciones de proteína en las muestras de tejido. Se prepararon reactivos de trabajo y diluciones estándar de proteína para construir la curva estándar de proteína. Se colocaron 5 μL de estándares y muestras de tejido en pocillos apropiados, seguidos de 25 μL y 200 μL de los reactivos de trabajo A y B respectivamente. La absorbancia se leyó a 750 nm después de 15 min utilizando un lector de microplacas (Spinco Biotech Pvt. Ltd., India). A partir de los resultados de este ensayo, se calculó la cantidad de proteína en cada muestra de prueba equivalente a 50 μg de proteína estándar para la carga adicional en el proceso de transferencia.

La cantidad requerida de muestras de prueba se mezcló con una cantidad igual de tampón Laemmli y se usó para la transferencia. Se prepararon geles de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) a partir del gel de resolución de acrilamida al 10% (TGX Stain-FreeTM FastCastTM Acrylamide Kit, Bio-Rad, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Se introdujeron marcadores de proteína estándar (Precision Plus, Kaleidoscope, Biorad) y muestras de tejido preparadas previamente en diferentes pocillos de los geles SDS-PAGE colados. La electroforesis se llevó a cabo en un sistema de fuente de alimentación de electroforesis Mini-PROTEAN® Tetra System y PowerPacTM HC (Bio-Rad, CA, EE. UU.). Después de la electroforesis, el gel embebido en proteína se transfirió a 15 mV (15 min) a una membrana de nitrocelulosa en la máquina Trans Blot Turbo. A continuación, la membrana incrustada con bandas de proteína se transfirió a una placa petri nueva y se incubó en un agitador oscilante (Rockymax, Tarsons, Kolkata, India) durante 1 h en una solución de bloqueo que consistía en solución salina tamponada Tris (TBS) con Tween 20 al 0,1 % y 5 % de albúmina sérica bovina (BSA). Después de 1 h, se descartó la solución de bloqueo y se lavó la membrana tres veces (3 min/lavado) con solución de TBST. La solución de TBST se pipeteó por completo y, sin secar las membranas, se añadieron anticuerpos primarios específicamente diluidos a las membranas. Las membranas se probaron por separado con anticuerpos primarios anti-OBP2A y TRPV1 y β-actina (diluidos en BSA al 5 % en solución salina tamponada con Tris, pH 7,4) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, la membrana se lavó en TBST 3 veces (5 min/lavado), seguido de 1 h de incubación con anticuerpos secundarios unidos a peroxidasa de rábano picante (HRP) (diluidos en BSA al 5 % en solución salina tamponada con Tris, pH 7,4, (detalles mencionado en la Tabla complementaria S5) en un agitador oscilante a 4 ° C. Después de la incubación, se agregó sustrato ECL recién preparado a las membranas y se visualizó e interpretó inmediatamente en G: Box Chemi-XRQ gel doc system (Syngene, Reino Unido). de bandas se calculó con SynGene GeneTools (SynGene Laboratories, Cambridge, Reino Unido). Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. Todos los pasos de cuantificación de bandas de WB se realizaron utilizando ImageJ personalizado (Institutos Nacionales de Salud; http://rsb.info. nih.gov/ij/) guión.

Se llevó a cabo un estudio de acoplamiento molecular para encontrar el(los) componente(s) de los EO que tienen tendencia a unirse con el(los) objetivo(s) asociado(s) con la actividad repelente. Los componentes de los aceites esenciales utilizados en la formulación se identificaron a partir del análisis GC-MS. Luego, la identificación SMILE de los compuestos se recuperó de la base de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) y se cargó en el software de modelado molecular Discovery Studio 2020 (DS 2020) (Dassault BIOVIA, San Diego, EE. UU. )76. Se generaron las estructuras 3D de los compuestos y se realizó la minimización de energía de los compuestos de acuerdo con el protocolo estándar de DS 2020 utilizando el método de minimización inteligente77. Las proteínas diana proteína de unión a olor (OBP) para especies de Aedes (PDB: 3K1E) y para especies de Anopheles (PDB: 3QME) y TRPV1 para rata (PDB: 5IS0) se descargaron del banco de datos de proteínas (www.rcsb.org)78 . Las proteínas diana se limpiaron, prepararon y luego se minimizó la energía utilizando el método de "minimización inteligente" durante 2000 pasos con un gradiente de energía RMSD de 0,01 kcal/mol77. Después de eso, los sitios de unión para el estudio de acoplamiento se seleccionaron utilizando la información proporcionada en Protein Data Bank para los sitios activos de los objetivos seleccionados. Los sitios activos para OBP de las especies de Aedes fueron X: 13,63, Y: 40,63, Z: 24,92 y radio 9,8 Å; para OBP de especies de Anopheles fue X: 20,17, Y: 31,50, Z: 32,09 y radio 7,7 Å; para TRPV1 de ratas fue X: 107.77, Y: 92.80, Z: 103.16 y radio 9.3 Å (Fig. S4 complementaria). Luego, se llevó a cabo un estudio de acoplamiento utilizando el protocolo de acoplamiento basado en simulación CDocker de DS 2020, que proporciona información comparativamente más precisa sobre la unión de un compuesto en el sitio activo79. También se analizaron las mejores poses de acoplamiento generadas para observar las diferentes interacciones de no unión que tenían lugar entre las proteínas y los compuestos objetivo.

La energía libre de unión basada en MM-PBSA proporciona información precisa sobre la estabilidad termodinámica del complejo proteína-ligando en condiciones fisiológicas reales80,81. Por lo tanto, las mejores poses de los compuestos seleccionados del acoplamiento se analizaron más a fondo para calcular las energías libres de unión (ΔG) utilizando el método MM-PBSA.

El presente estudio investiga la actividad repelente de una formulación no tóxica de EO-MRC contra mosquitos, según los estándares internacionales. EO-MRC probado aquí, ha pasado con éxito el estudio de eficacia contra Ae. albopictus y toxicidad preclínica en diferentes animales de laboratorio según las directrices de ensayo de la OCDE. El producto desarrollado brinda una protección efectiva de hasta 228 min, contra Ae. albopictus sin producir ningún peligro para la salud en entornos preclínicos. Por lo tanto, el estudio general corrobora el desarrollo de una formulación de crema tópica no tóxica, de mayor duración y basada en EO para minimizar estratégicamente las picaduras de mosquitos y disminuir los incidentes de enfermedades transmitidas por mosquitos. Sin embargo, este estudio no es concluyente, se deben realizar más estudios sobre pruebas de repelencia utilizando diferentes cepas de mosquitos, con diferentes procedimientos de bioensayo como bioensayo de túnel, olfatómetro de tubo en Y, etc. Las pruebas de toxicidad no objetivo, las pruebas de estabilidad o la evaluación de la vida útil del EO-MRC son esenciales para obtener resultados más concluyentes. En el futuro, la formulación de emulsión múltiple y/o crema liposomal podría diseñarse para la liberación controlada de formulaciones anti-mosquitos en la piel expuesta para lograr el máximo tiempo de protección. Esto reduciría la frecuencia de dosificación en condiciones exteriores. El estudio sobre la expresión de una proteína más sensible al olor disponible en la parte de la cabeza del mosquito podría contribuir a que la comunidad científica comprenda el mecanismo más detallado del químico repelente. El presente informe beneficiará a estudiantes de investigación, científicos de formulación y compañías farmacéuticas para desarrollar repelentes de mosquitos a base de hierbas efectivos, seguros y de mayor duración que podrían aplicarse a viajeros, militares en operaciones en la jungla o al público en general en áreas endémicas de mosquitos para protegerse de los mosquitos.

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Hemanga Hazarika agradece a la Organización de Investigación y Desarrollo de Defensa (DRDO), Ministerio de Defensa, Gobierno. de la India, por otorgar becas de investigación (DRL/1206/TC/JRF/04). Los autores expresan su agradecimiento especial al Laboratorio de Investigación de Defensa (DRL), Tezpur, Assam, India, y a la Administración de la Universidad de Dibrugarh (DU), Dibrugarh, Assam, India, por brindar todo el apoyo necesario para el trabajo de investigación doctoral. El autor también agradece al Dr. Rishi Hazarika, MD, director sénior de Pfizer, Londres, Reino Unido, por revisar este manuscrito y brindar sugerencias para mejorarlo. Un sincero agradecimiento al Dr. Sourav Chakraborty, Profesor Asistente, Departamento de Ingeniería y Tecnología de Alimentos, Universidad de Tezpur, Assam, India, por proporcionar los informes de TGA a tiempo; Sumit Kishor, asistente técnico sénior, DRL, Tezpur, Assam, India, por proporcionar datos de GC-MS; y Polopalli Subramanyam Raju, JRF, DRL, Tezpur, por ayudar en los estudios de AEI. También se agradece a todos los revisores anónimos por sus comentarios específicos que ayudaron mucho a mejorar este manuscrito.

División de Tecnología Farmacéutica, Laboratorio de Investigación de Defensa, Tezpur, Assam, 784001, India

Hemanga Hazarika, Harshita Krishnatreyya, Danswrang Goyary y Pronobesh Chattopadhyay

Instituto Girijananda Chowdhury de Ciencias Farmacéuticas, Dekargaon, Tezpur, Assam, 784501, India

Hemanga Hazarika y Harshita Krishnatreyya

Eurofins Agrociencia Servicios Pvt. Ltd., Tirupur, Tamil Nadu, 641603, India

Varun Tyagui

Coromandel Int. Ltd., Shameerpet, Telangana, 500101, India

Johirul Islam

Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Dibrugarh, Dibrugarh, Assam, 786004, India

Hemanga Hazarika, Neelutpal Gogoi y Kamaruz Zaman

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HH y HK contribuyeron a la conceptualización, metodología, análisis, investigación, redacción del borrador original. VT y JI contribuido al bioensayo de mosquitos y revisó el manuscrito. NG realizó acoplamiento molecular in silico. DG supervisó los experimentos con respecto a la transferencia de Western. PC y KZ conceptualizaron y supervisaron todo el experimento.

Correspondencia a Hemanga Hazarika o Pronobesh Chattopadhyay.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Hazarika, H., Krishnatreyya, H., Tyagi, V. et al. La fabricación y evaluación de crema repelente de mosquitos para protección exterior. Informe científico 12, 2180 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-06185-9

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Recibido: 19 julio 2021

Aceptado: 25 de enero de 2022

Publicado: 09 febrero 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-06185-9

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