Análisis detallado del retinal distorsionado y su interacción con los residuos circundantes en el intermedio K de la bacteriorrodopsina - Almacenamiento criogénico Co., Ltd de Chengdu

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 190 (2023) Citar este artículo

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El intermedio K de la bacteriorrodopsina de bombeo de protones es el primer intermedio generado después de la isomerización del retinal a la forma 13-cis. Aunque hasta ahora se han informado varias estructuras para el intermedio K, estas difieren entre sí, especialmente en términos de la conformación del cromóforo retiniano y su interacción con los residuos circundantes. Presentamos aquí un análisis cristalográfico de rayos X preciso de la estructura K. Se observa que la cadena poliénica del retinal 13-cis tiene forma de S. La cadena lateral de Lys216, que está unida covalentemente al retinal a través del enlace de base de Schiff, interactúa con los residuos, Asp85 y Thr89. Además, el Nζ-H del enlace de base de Schiff protonado interactúa con un residuo, Asp212 y una molécula de agua, W402. Basándonos en cálculos de química cuántica para esta estructura K, examinamos los factores estabilizadores de la conformación distorsionada del retinal y proponemos una forma de relajación para el siguiente L intermedio.

La bacteriorrodopsina (bR) es una bomba de protones impulsada por la luz que se produce en la membrana plasmática de una arquea, Halobacterium salinarum1,2, y actualmente es una de las proteínas de membrana más estudiadas3,4. Se han descubierto rodopsinas microbianas similares que actúan como bombas de iones, canales y sensores no solo en arqueas sino también en bacterias, hongos e incluso virus5,6,7. Todas estas proteínas, como bR8, tienen siete hélices transmembrana y un cromóforo retinal central. El retinal tiene una columna vertebral de polieno con enlaces dobles conjugados largos. En el caso de bR, el cromóforo retiniano forma un enlace de base de Schiff (SB) con un residuo de lisina en la posición 216 (Lys216). Retinal toma una conformación totalmente trans en el estado de reposo adaptado a la luz. La absorción de luz provoca la isomerización de un doble enlace en C13-C14 del retinal de una conformación trans a cis. Los cambios estructurales se propagan a la porción de proteína y se expresan las funciones respectivas.

En el caso de bR, se produce un ciclo de reacción en el que se generan secuencialmente una serie de intermedios (I, J, K, L, M, N, O). En el ciclo de reacción de bR, se transporta un solo protón desde el interior hacia el exterior de la membrana plasmática. El intermedio K, que se caracteriza por un pico de absorción a 590 nm a temperatura ambiente9, es el primer intermedio generado después de la isomerización del retinal a la forma 13-cis. El intermedio K puede quedar atrapado por la irradiación de luz a temperaturas criogénicas10. Se ha demostrado que el intermedio K producido a temperaturas criogénicas tiene casi las mismas características en las bandas vibratorias que los producidos transitoriamente a temperatura ambiente11,12. La estructura del intermedio K se investigó por primera vez mediante la técnica de captura criogénica en combinación con cristalografía de rayos X13,14,15,16 (Tabla complementaria 1). La estructura también se investigó mediante estudios cristalográficos de femtosegundos en serie resueltos en el tiempo (TR-SFX) 17,18,19 (Tabla complementaria 1). Estas investigaciones revelaron que los cambios estructurales tras la formación del intermedio K son pequeños y aún se limitan a la vecindad alrededor de la retina. Por lo tanto, el intermedio K es un tema de investigación interesante con el potencial de proporcionar información sobre el almacenamiento y la propagación de energía dentro de las proteínas. Sin embargo, se pueden encontrar muchas inconsistencias entre las estructuras K informadas anteriormente en la conformación del retinal y los detalles de su interacción con los residuos circundantes. Por esta razón, los puntos cruciales en el almacenamiento y la propagación de la energía dentro de las proteínas siguen siendo poco conocidos, aunque se ha hecho una estimación de la energía almacenada ~50 kJ/mol20.

La capacidad de manipular células mediante la luz ha llevado recientemente al uso de rodopsinas impulsadas por la luz para la activación deliberada de neuronas y otras células mediante optogenética21,22. Además, se han realizado extensos estudios sobre el uso de bR en materiales fotográficos23,24. En cuanto al desarrollo de aplicaciones utilizando rodopsinas y otras proteínas fotoactivas, es importante dilucidar el mecanismo por el cual la fotoisomerización del cromóforo se traduce en movimientos funcionales en las proteínas. Por lo tanto, en este estudio, nos enfocamos en bR, que es una de las proteínas fotoactivas mejor estudiadas, y realizamos un análisis estructural de alta resolución para determinar con precisión la conformación de su cromóforo retiniano y las interacciones con la proteína circundante en el intermedio K.

Para acumular el intermedio K, empleamos un procedimiento de captura criogénica15 en el que se irradió un cristal bR adaptado a la luz con una luz verde a 100 K (Fig. 1a). Los datos de difracción de un cristal que incluye el intermedio K a ~1,3 Å se recogieron a 15 K con una dosis absorbida de 0,05 MGy. Este valor de dosis de absorción fue un tercio del límite a 15 K25. Posteriormente, los datos de difracción del estado fundamental se recopilaron del mismo cristal después de la irradiación de luz roja. El valor promedio de I/σ(I) para el caparazón más alto (1,42–1,33 Å) fue un valor suficientemente alto de ~1,4, cuando el límite de resolución se determinó como un caparazón con CC1/2 de ~0,5 (Tabla 1). Al igual que en estudios previos, se observaron densidades significativas solo alrededor de la retina en el mapa de diferencia de Fourier (Fig. 1b). Por otro lado, no se observaron densidades de electrones diferentes en las regiones alejadas de la retina, como el sitio de captación de protones, el sitio de liberación de protones o la superficie de la proteína. Las densidades positivas y negativas más fuertes se observaron alrededor del enlace SB y el átomo C20 de retinal (Fig. 1c). Además, se observaron pares de densidades relativamente fuertes en los átomos C14 y C15. También se observaron densidades relativamente fuertes correspondientes a cambios en átomos individuales de las otras porciones de retinal, la cadena lateral de Lys216 y los residuos circundantes. Por lo tanto, fue posible determinar la estructura del intermedio K sin ambigüedades (Fig. 1 complementaria).

a Fotoisomerización del retinal. El retinal todo trans, que está vinculado con Lys216 de bR a través del enlace SB, se isomeriza a retinal 13-cis por absorción de luz verde. Una reacción inversa es causada por la absorción de la luz roja. b Una vista completa del mapa de diferencias F(K + bR) − F(bR). Las densidades de electrones diferentes en los niveles +4σ y −4σ se muestran como mallas verdes y rojas, respectivamente. La estructura de bR se representa como un tubo en gris, mientras que el retinal se muestra como barras en gris oscuro. c Una vista de primer plano alrededor del cromóforo retiniano. La estructura K se representa con barras de colores, mientras que la estructura del estado fundamental se representa con barras grises. El mapa de diferencia F(K + bR) − F(bR) se muestra como mallas verdes y rojas en niveles de contorno de ±3σ. El mapa de omisión para la retina y la cadena lateral de Lys216 calculada a partir de los datos extrapolados se superpone como mallas grises en un nivel de contorno de +3σ.

Pudimos recopilar datos al mismo nivel de resolución de otro cristal (Tabla complementaria 2). Usando los datos, obtuvimos un mapa de Fourier de diferencia casi idéntico (Figura complementaria 2a, b). Además, cuando los datos del estado fundamental se recopilaron por primera vez antes de los datos del estado K, el mapa de diferencia de Fourier mostró casi las mismas densidades que en los casos anteriores (Figura complementaria 2c, d). Este hecho indica que la dependencia de la secuencia de medida no es tan grande para los cambios estructurales entre bR y K, como sugieren las medidas espectroscópicas26. También muestra que los rayos X no ejercieron efectos dañinos a una dosis total de ~0.1 MGy. De hecho, las tres estructuras K deben ser casi idénticas según la superposición (Fig. 3 complementaria), aunque solo la forma del bucle EF en el cristal II difiere de los otros dos. Esto puede deberse a la diferencia en la constante de red del eje c (Tabla complementaria 2). De hecho, la desviación cuadrática media (rmsd) entre K en el cristal II y K en el cristal I es de 0,9 Å, mayor que 0,4 Å de rmsd entre K en el cristal III y K en el cristal I.

En cuanto al estado fundamental, los datos de difracción de rayos X del cristal I y II se midieron después de la activación con láser verde y la posterior restauración con láser rojo, mientras que los datos del cristal III se midieron antes de la activación. Sin embargo, tres estructuras también son casi idénticas como en el caso de las estructuras K (Fig. 4a-c complementaria). Esto implica que el proceso de activación no afecta la estructura del estado fundamental. Esta implicación también está respaldada por el hecho de que el mapa de diferencia de Fourier entre los datos del cristal I y el cristal III no muestra densidades significativas alrededor de la retina y el canal de protones (Fig. 4d-f complementaria).

Ajustando la estructura del retinal a la densidad electrónica con alta resolución, fue posible determinar la conformación del retinal con gran precisión. Las desviaciones estándar de los ángulos diédricos de la cadena de polieno fueron ~10° en la estructura K. La cadena de polieno se dobla en gran medida hacia el lado de la hélice F cerca del átomo C14, y el enlace C13-C20 se inclina hacia el lado Tyr185 de la hélice F (Fig. 2a). Por otro lado, la cadena de polieno se dobla contra la hélice B cerca del átomo C9. Como resultado, el retinal 13-cis en el intermedio K se curva en forma de S cuando se ve desde el lado citoplásmico. Esta conformación retiniana podría proporcionar una muy buena explicación de la diferencia de densidades de electrones en el mapa de diferencias de Fourier. Cuando se compararon los ángulos de torsión entre bR y K, la diferencia más significativa se encontró en el enlace C13-C14 que ocurre en la isomerización trans-cis (Fig. 2b). Sin embargo, la diferencia fue ~120°, no 180°. Debido a cambios en otros enlaces, la orientación del enlace Nζ−H en K finalmente cambia solo 24° con respecto al estado fundamental. Este pequeño cambio relativo fue consistente con un resultado FTIR polarizado previo de ~25°, mientras que los ángulos absolutos de la membrana normal no concordaban27. La siguiente diferencia más grande en la cadena de polieno se encontró en un ángulo de torsión del enlace C15−Nς. Además, se encontraron pequeños cambios significativos en la mayoría de los otros ángulos de torsión en la cadena de polieno del retinal. El mapa de diferencia de Fourier indicó que la posición del anillo de β-ionona se desplaza ligeramente hacia la dirección SB debido a la curva en forma de S del polieno (Fig. 1c). En cuanto a la cadena lateral de Lys216, que forma el enlace SB con retinal, los ángulos de torsión para los enlaces Cε−Nζ y Cδ−Cε no mostraron desviaciones significativas del estado fundamental a pesar del enlace simple, lo que indica la estabilización por interacciones con el entorno. residuos

una columna vertebral de polieno en forma de S de retinal vista desde la parte superior de la Fig. 1b. Los mapas se muestran de la misma manera que en la Fig. 1b. b Los ángulos de torsión a lo largo de la cadena de polieno retinal en la estructura K (7XJC) se trazan en magenta. Las desviaciones estándar, que se calcularon a partir de tres estructuras, se indican como barras de error en los valores medios que se muestran como círculos huecos. Los valores de las respectivas estructuras se muestran como cruces. Los valores se pueden encontrar en la Tabla complementaria 4. Los de la estructura del estado fundamental en este trabajo (7XJD) y una estructura L reciente16 se representan en gris y negro, respectivamente. Las líneas negras horizontales indican ángulos con energías mínimas locales para las respectivas torsiones.

Aunque los cambios estructurales se limitan a la vecindad del retinal, los detalles atómicos del cambio estructural tras la formación del intermedio K podrían observarse claramente en los residuos circundantes. Para la cadena lateral de Lys216, Cε y Cδ se mueven hacia la hélice G además de Nς de SB (Fig. 3a). Se observaron densidades de diferencia débiles a lo largo de la cadena principal de residuos en la hélice G de Phe208 a Gly218. Por la inclinación del enlace C13−C20, Tyr185 se mueve hacia Leu211, induciendo el movimiento de Leu211 (Fig. 2a y Fig. 3b). La cadena lateral de Trp86 gira alrededor del eje Cα−Cβ, llenando la porción cóncava de retinal generada por la isomerización trans-cis (Fig. 3b). Las cadenas laterales de Arg82 y Phe208 también se desplazan por el movimiento. Ser141 en la hélice E y Pro186 en la hélice F se mueven hacia el anillo de ionona del retinal (Fig. 3c). Además, varios residuos pertenecientes a la hélice E (Ala139–Thr142) y la hélice F (Leu181–Val187) también se mueven ligeramente con ellos. Los cambios estructurales en las cadenas principales de las hélices E, F y G pueden estar relacionados con bandas peptídicas insensibles al intercambio H/D observado en la diferencia de espectros FTIR28.

a Una sección transversal de retinal en el enlace SB. El mapa de diferencia F(K + bR) − F(bR) se muestra como mallas verdes y rojas en niveles de contorno de ±3σ. Las estructuras K se representan como palos de colores. La estructura del estado fundamental se superpone como barras grises. b Una sección transversal de retinal en el medio de la columna vertebral de polieno. c Una sección transversal de retinal en el anillo de ionona β. d El mapa alrededor de Asp85. e El mapa alrededor de Asp212. f El mapa alrededor de Asp115.

La distancia del enlace de hidrógeno entre Asp85 y Thr89 solo se acorta ligeramente incluso por el movimiento de la cadena lateral de Thr89 hacia la retina tras la formación del intermedio K (Fig. 3d). La distancia del enlace de hidrógeno entre Asp85 y W402 aumenta en comparación con la estructura del estado fundamental. Por otro lado, la distancia entre Asp212 y W402 se acorta a 3,08 Å, aunque la distancia en estado fundamental es de 3,40 Å (Fig. 3e). La distancia entre Lys216 y Asp212 también se acorta de 3,93 Å para el estado fundamental a 3,27 Å para K por la rotación alrededor del enlace Cβ−Cγ de Asp212 además de la isomerización del retinal. Cabe señalar que se observó una rotación similar en Asp212 en los intermedios I y J anteriores, pero no en K, en un estudio TR-SFX18. Un aspartato protonado, Asp115, en la vecindad de la retina parece no tener participación directa en el bombeo de protones. Asp115 forma dos enlaces de hidrógeno con Thr90, tanto en el estado fundamental como en el intermedio K (Fig. 3f). Sin embargo, la forma de enlace de hidrógeno cambia ligeramente al moverse Asp115. Esto puede corresponder a un cambio en el entorno de Asp115 sugerido por un resultado FTIR anterior29.

Debido a los grandes cambios de posición de C20 por la isomerización del retinal, la distancia entre C20 y Cε1 de Tyr185 en la hélice F se reduce a 3,45 Å desde 4,25 Å en el estado fundamental (Fig. 4a y Fig. 5a complementaria). Sin embargo, las distancias entre C13 y los átomos de Tyr185 no cambian en gran medida. En cuanto a la forma de interacción entre C20 y Trp182 ubicado en el lado citoplasmático de la retina, la distancia a Cδ1 de Trp182 se reduce a 3,22 Å desde 3,76 Å, mientras que la distancia entre C20 y Nε1 de Trp182 casi no cambia. En nuestra estructura K no se observan interacciones energéticamente desfavorables con distancias cortas. Por lo tanto, se puede suponer que las interacciones CH∙∙∙π y π∙∙∙π observadas entre el retinal y estos residuos circundantes son interacciones atractivas.

a Se muestran las distancias interatómicas de <3,5 Å entre la retina y los residuos circundantes, mientras que las del estado fundamental están entre paréntesis. Las líneas punteadas están coloreadas de acuerdo con los cambios de las distancias en la formación de K, con rojo y azul que indican una gran disminución (> 0,2 Å) y un gran incremento, respectivamente. b Se muestran enlaces de hidrógeno con distancias de <3,5 Å en el lado EC del enlace SB, mientras que los del estado fundamental están entre paréntesis.

Para los enlaces de hidrógeno en el lado EC del enlace SB, solo Nζ de Lys216 muestra cambios significativos en la formación de K (Fig. 4b y Fig. 5b complementaria). Aunque la distancia entre Nζ de Lys216 y Oδ1 de Asp212 en el estado fundamental es de 3,93 Å, lo que indica que no hay una interacción significativa, se reduce a 3,27 Å en el intermedio K. La distancia entre Nζ de Lys216 y W402 aumenta de 0,28 Å a 3,07 Å. Los niveles de σ de las diferencias para estas dos distancias fueron mayores que 6. Por otro lado, los valores para los otros enlaces de hidrógeno fueron inferiores a 3, lo que indica que los cambios de distancias en estos enlaces de hidrógeno son niveles insignificantes (Tabla complementaria 3) .

Hasta el momento, se han reportado tres y dos estructuras de rayos X determinadas con las técnicas de crio-trampa y TR-SFX, correspondientemente, para el intermedio K13,14,15,16,17,18,19. Aunque la conformación de la retina en la mayoría de las estructuras tomó conformaciones distorsionadas como lo predijeron los datos espectroscópicos30, estos datos mostraron una gran variación en las estructuras cristalográficas (Fig. 5a). El grado de diferencia parecía no depender del método utilizado para producir el intermedio K. Las mayores discrepancias se encontraron en las posiciones de los átomos C13, C14 y C20 del retinal. Como resultado, entre las diversas estructuras, la variación fue de ~60° para C13−C14 y C15−Nζ, mientras que las variaciones para los otros ángulos de torsión fueron ~40° para los ángulos de torsión de la cadena de polieno retiniano (Fig. 6 complementaria ). Estas variaciones fueron significativamente mayores que las del estado fundamental, lo que indica la ausencia de parámetros estructurales confiables para el intermedio K (Fig. 5b). En nuestra estructura, los ángulos de torsión de C13−C14 y C15−Nζ fueron −38° y 143° respectivamente, y las desviaciones estándar calculadas a partir de tres estructuras (Cristales I−III) fueron 14° y 11°, respectivamente (Tabla complementaria 4 ). Estos valores estaban en el centro de otros resultados en la gráfica (Fig. 5b). Las estructuras más cercanas en el gráfico del ángulo de torsión fueron 6G7K18 y 1M0K14. Aunque las posiciones de los átomos C13, C14 y C20 en 6G7K18 eran cercanas a las de nuestros resultados, las de 1M0K14 eran bastante diferentes. Esta diferencia fue causada por la planaridad de la cadena de polieno entre C9 y C13. Estas desviaciones de 180° también contribuyeron a la curvatura de la cadena de polieno, dando como resultado la conformación en forma de S.

a Superposición de varias estructuras K. Átomos de carbono en 1QK0 reportados por Edman et al.13, 1M0K por Schobert et al.14, 1IXF por Matsui et al.15, 6G7K por Nogly et al.18 y 6GA6 por Nass Kovacs et al.19, 7Z0C por Borshchevskiy et al. al.16 y 7XJC informados en este trabajo están coloreados en verde, amarillo, cian, naranja marino y magenta, respectivamente, mientras que los átomos de nitrógeno (azul) son comunes. b Distribución de los ángulos de torsión de los dobles enlaces conjugados (C13−C14 y C15−Nς) en la retina. Los ángulos de torsión para las estructuras K se trazan como círculos rellenos en los mismos colores que se usan para los átomos de carbono en el panel a, mientras que los correspondientes a las estructuras del estado fundamental (1QKP13, 1M0L14, 1IW615, 6G7H18, 6RMK19, 7Z0916 y 7XJD) son trazados como diamantes llenos. Para las estructuras K y de estado fundamental en este estudio, las desviaciones estándar calculadas a partir de tres estructuras para cada una se muestran como barras de error en los valores medios que se muestran como círculos huecos. Los puntos de datos para las estructuras respectivas en este estudio se muestran como cruces.

Debido a la variedad en la conformación del retinal, también se observaron diferencias significativas en las interacciones entre el retinal y los residuos circundantes, como Trp182 y Tyr185 (Fig. 7 complementaria). Una de las estructuras K (1QK0) 13 exhibió la forma de interacción más diferente en comparación con la de nuestra estructura (Fig. 7a complementaria). Por otro lado, otra estructura K (6G7K) 18 parecía ser la más similar a la nuestra en términos de interacciones alrededor de la retina, mientras que se encontraron algunas distancias inusualmente cercanas entre la retina y Tyr185 (Fig. 7d complementaria). Además, también se observó una distancia corta de 2,28 Å en el enlace de hidrógeno entre Tyr185 y Asp212. Debido a que las posiciones de los átomos en el retinal eran muy similares, la diferencia con nuestra estructura K se debió al grado de cambios estructurales en Tyr185 (Fig. 4a y Fig. 7d complementaria). En cuanto a 7Z0C16, el tamaño del cristal, las condiciones experimentales y la edad de medición son muy similares a los de 7XJC en este estudio. Sin embargo, existen diferencias no despreciables en las posiciones de los átomos C13, C14 y C20 en retinal (Fig. 5a). Esto probablemente se deba a la diferencia en el ángulo de torsión del enlace simple Cε−Nζ, más que a la diferencia en los ángulos de torsión de los dobles enlaces conjugados en la cadena poliénica del retinal. En consecuencia, una marcada diferencia resultó en la orientación del Nζ−H. Estos también pueden ser una razón para las diferencias significativas en la interacción con Tyr185 (Fig. 4a y Fig. 7f complementaria). Una posible razón de la diferencia podría ser el número de repeticiones del cambio bR↔K durante la medición de los datos de difracción. En la recopilación de datos de difracción de 7XJC, los datos de difracción de K + bR irradiados con luz verde se midieron primero para obtener la estructura K lo más libre posible de daños por rayos X, como se describe anteriormente. Por otro lado, en la toma de datos de 7Z0C, el bR↔K se repitió muchas veces con ángulos cambiantes19.

La estructura complementada con átomos de hidrógeno se obtuvo mediante cálculos QM/MM a partir de nuestra estructura K para realizar investigaciones detalladas de las interacciones en torno al enlace SB. La estructura optimizada se examinó mediante el gráfico de interacción no covalente (NCI), que es una isosuperficie del gradiente de densidad reducido calculado a partir de una densidad de electrones ρ31,32. Había una superficie verde azulada en el gráfico NCI entre el protón amida en Nζ de Lys216, que forma el enlace SB, y Oδ1 de Asp212, lo que indica la presencia de una interacción relativamente fuerte (Fig. 6a). Esta interacción puede haber sido mejorada por la atracción electrostática entre la carga positiva en Nζ de Lys216 y la carga negativa en Oδ1 de Asp212. Además, la interacción entre Nζ de Lys216 y W402 también se observó como una superficie verde azulada. Por otro lado, hubo superficies verdes entre los átomos de hidrógeno de metileno del Cε de Lys216 y los átomos de oxígeno e hidrógeno de Thr89, lo que indica la presencia de interacciones atractivas de van der Waals. Además, se observó una superficie verde NCI entre el Cε de Lys216 y el Oδ1 de Asp85, lo que sugiere un enlace de hidrógeno tipo CH∙∙∙O33. Por lo tanto, se sugirió que la rotación de los enlaces Cε−Nζ y Cδ−Cε estaba inhibida por estas interacciones entre el Cε y el Nζ de Lys216 y los residuos circundantes (Fig. 6b). De hecho, la porción de la cadena de polieno del retinal en el intermedio K mostró desviaciones de los 180 ° o 0 ° que deberían tomar a pesar del doble enlace, mientras que la cadena lateral de Lys216 mostró poca desviación a pesar de los enlaces simples (Fig. 2b).

a La gráfica NCI para el lado EC del enlace SB. Los átomos de hidrógeno se agregan de acuerdo con la optimización con el cálculo QM/MM. La isosuperficie de gradiente de densidad reducida en s(ρ) = 0,5 se agrega como superficies coloreadas. La naturaleza de la interacción se puede visualizar por el color según el valor del signo(λ2)ρ en una unidad atómica (e a0−3), donde λ2 y el signo(λ2) son el segundo valor propio de la matriz de Hesse de ρ y su signo, respectivamente. La escala de colores se encuentra en la parte inferior derecha del panel. Azul, verde y rojo corresponden a atracción, atracción débil y repulsión, respectivamente. Las flechas azules indican la interacción entre los átomos de H de Cε en Lys216 y Thr89. La flecha verde indica la interacción entre H de Cε en Lys216 y Asp85. La flecha naranja indica la interacción entre H de Nς en Lys216 y W402. La flecha morada indica la interacción entre H de Nς en Lys216 y Asp212. b Las interacciones con los residuos circundantes (Asp85, Thr89 y Asp212) y Water402 evitan la rotación torsional en los enlaces Nς–Cε y Cε–Cδ en Lys216. c La curva de energía potencial de torsión para el enlace Nς–Cε. Los ángulos de torsión en K/bR y L son ~+240° y +120°, respectivamente. d La curva de energía potencial de torsión para el enlace Cε–Cδ. Los ángulos de torsión en K/bR y L son aproximadamente +60° y −60°, respectivamente.

Aunque recientemente se han informado estructuras de alta resolución de otros estados de bR16,25, la de K ha permanecido ambigua a pesar de la importancia de la estructura distorsionada en el mecanismo de transporte de protones. Sin embargo, según el análisis estructural del intermedio K a ~ 1.3 Å en este estudio, pudimos obtener las formas de interacción precisas, así como la conformación del retinal 13-cis distorsionado. Al comparar la conformación de la retina en K en este estudio con la de una estructura L reciente16, se observaron cambios significativos en los ángulos de torsión de los enlaces C13-C14, C14-C15 y C15-Nζ. Este hecho indica que la torsión en la cadena poliénica del retinal en el intermedio K se ha relajado en el intermedio L. Además de esos cambios, los enlaces Cε−Nζ y Cδ−Cε rotaron ~120° para formar otro isómero rotacional. Por lo tanto, se encontró que el intermedio K estaba estabilizado por las interacciones entre Cε/Nζ y los residuos circundantes. Esto proporcionó información sobre cómo ocurren las rotaciones alrededor de los enlaces Cε−Nζ y Cδ−Cε durante la transición al intermedio L. Por lo tanto, podríamos interpretar que los subestados del intermedio K que se ha sugerido que existen se generan debido a cambios en el ángulo diedro de la cadena poliénica del retinal y la cadena lateral de Lys216. Se han propuesto algunos subestados, como K0, KE y KL, en el intermedio K34,35,36. Algunas de las diversas estructuras cristalográficas de K, que son diferentes entre sí como se describe anteriormente, pueden ser tales subestados capturados por condiciones experimentales ligeramente diferentes (Tabla complementaria 1). Por lo tanto, un examen de las diferencias en cada estructura puede proporcionar información sobre los subestados en el intermedio K. Basado solo en las diferencias en la interacción entre Nζ-H y W402 y/o Asp212 (Fig. 8 complementaria), el cambio cerca de SB se puede proponer como J → 7XJC (este trabajo) → 1M0K14 → 6GA619 → 1IXF15 → 6G7K18 → 7Z0C16 → 1QK013 → L. Sin embargo, no es posible determinar claramente la correspondencia entre estos y los subestados propuestos hasta el momento. Además, la orden no puede explicar los cambios en la distorsión de la retina y el movimiento de Tyr185. Además, se requieren algunas precauciones en la discusión de la siguiente manera. 1QK013 y 1M0K14 se determinaron en análisis en los que no se tuvieron suficientemente en cuenta las influencias del daño por rayos X. 1IXF15 tiene una resolución más baja que los demás, a pesar de que se han realizado esfuerzos para examinar y eliminar los efectos del daño de los rayos X. Sin embargo, para 1QK013, existe una clara diferencia con respecto a otros K intermedios con respecto al ángulo de rotación alrededor del enlace Cε−Nζ (Fig. 6 complementaria). Por lo tanto, la posibilidad de que 1QK013 sea una captura experimental de un subestado (KL) propuesta por un estudio computacional37 es altamente plausible incluso en presencia de tales problemas. Por lo tanto, la rotación del enlace Cε−Nζ puede ocurrir antes de la rotación del enlace Cδ−Cε. Esto puede corresponder al hecho de que la profundidad del potencial alrededor del enlace Cε−Nζ (~10 kJ/mol) es solo aproximadamente la mitad del potencial alrededor del enlace Cδ−Cε (~20 kJ/mol), debido a la hecho de que Nζ tiene solo un átomo de hidrógeno (Fig. 6c, d).

Hay dos escenarios para el cambio en el enlace de hidrógeno entre Nζ y W402 en la rotación del enlace Cε−Nζ. El primero es el caso en que este enlace de hidrógeno se rompe por rotación. En este caso, incluso después de la ruptura del enlace de hidrógeno, la molécula de agua W402 puede permanecer en la vecindad de su posición original por enlaces de hidrógeno con Asp85 y Asp212. En el segundo caso, por otro lado, el enlace de hidrógeno entre Nζ y W402 todavía se forma después de la rotación del enlace Cε−Nζ. En consecuencia, W402 es arrastrado hacia el lado CP por el enlace de hidrógeno como lo sugieren Kouyama et al.38. En este caso, la escisión de los fuertes enlaces de hidrógeno entre W402 y Asp212 o Asp85 debe ocurrir en este momento. Teniendo en cuenta la rotación alrededor del enlace Cδ−Cε inmediatamente después de la rotación del enlace Cε−Nζ, los átomos de hidrógeno de metileno de Cε pueden perturbar estos enlaces de hidrógeno. La migración de W402 durante la transición de K a L debe investigarse más a fondo mediante cálculos de dinámica molecular con referencia a nuestros hallazgos actuales.

No hay duda de que TR-SFX hace una gran contribución al estudio de los cambios conformacionales de proteínas. Sin embargo, los pulsos de luz intensa de los láseres de bombeo se han utilizado como disparadores en la determinación de los intermedios de reacción en TR-SFX39. Se ha señalado que la contribución de los procesos multifotónicos debido a las altas densidades de fotones puede ser problemática en tales experimentos40. En el caso de bR, la influencia de la absorción multifotónica por parte de Trp182 se vio como un problema40. El movimiento de las moléculas de agua lejos de la retina, como W401 y W406 en K o intermedios anteriores observados en los resultados de TR-SFX18,19, puede estar influenciado por esta absorción multifotónica (Figura complementaria 8d, e). Por tanto, a diferencia de los intermedios de fotorreacción que aparecen después de mucho tiempo, como el intermedio M, los efectos del alto flujo de fotones de los láseres de bombeo deben tenerse en cuenta en el caso del intermedio K, que aparece inmediatamente después de la fotoisomerización. Por otro lado, en el presente estudio, la estructura intermedia de K se determinó por el método de crio-trampa utilizando láseres (~0.1 W/cm2) con una intensidad de luz comparable a la de la luz solar, por lo que no existió este problema de absorción multifotónica. Por lo tanto, la importancia del intermedio K debe investigarse cuidadosamente mediante el uso de estructuras tanto de los métodos de resolución temporal como de criotrampa. Este estudio puede proporcionar un punto de partida para analizar la validez y las limitaciones de los resultados de TR-SFX con láseres de bombeo de alta intensidad. Antes de que podamos dilucidar el mecanismo detallado de la expresión funcional de las proteínas fotoactivas, también será necesaria una mayor investigación integral combinada con métodos computacionales41 para el campo de la biología estructural.

bR se purificó de la membrana púrpura de la cepa R1 de H. salinarum (JMC9409) mediante un protocolo estándar1. Los cristales de bR utilizados en este estudio fueron preparados por el método LCP como se describió previamente25. En resumen, se mezclaron 32 μL de la matriz LCP basada en monooleína suplementada con escualano al 1,6 % (Sigma-Aldrich) y trehalosa C16 al 8 % (Dojindo) con 20 μL de solución de bR de 15 mg/mL. Cada 2 μL de la mezcla se sumergió en 40 μL de fosfato de Na/K 2,0 M (pH 5,6) en un micropuente (Hampton Research, Aliso Viejo, CA) y se equilibró con 500 μL de fosfato de Na/K 2,0-2,5 M en una placa de cristalización de 24 pocillos. Los cristales se recolectaron después de 6 a 12 meses. El exceso de matriz de LCP que rodeaba los cristales de bR se eliminó con escualano42. Inmediatamente (dentro de ~1 min) después de la adaptación a la luz durante más de 5 min con una lámpara halógena blanca además de la luz de un microscopio, los cristales de bR se congelaron con un flujo de gas nitrógeno de 100 K y se almacenaron en un tanque de nitrógeno líquido.

Los experimentos de difracción se llevaron a cabo en la línea de luz BL41XU de SPring-8. El intermedio K del cristal I (350 × 350 × 30 μm3) se acumuló mediante la irradiación de luz de un láser verde (532 nm, ~1 mW) durante 5 min a 100 K. El cristal se giró ocasionalmente 180° durante el láser. irradiación. La temperatura se redujo a 15 K inmediatamente después de la irradiación con láser. Los datos de difracción para el intermedio K se recogieron con un detector Eiger X 16 M (Dectris). La distancia del detector, la longitud de onda de los rayos X y el tamaño del haz se establecieron en 135 mm, 0,80 Å, 50 × 20 μm2, respectivamente. Los datos de difracción para 110° se recopilaron con el método de recopilación de datos helicoidal en el que el rango de oscilación y el tiempo de exposición para un cuadro fueron 0,2° y 0,2 segundos, respectivamente. Los datos de difracción del estado fundamental se recopilaron posteriormente mediante las mismas condiciones de medición de cristales idénticos a 15 K, después de la irradiación de luz de un láser rojo (678 nm, ~1 mW) durante 5 min a 100 K. Los datos para el cristal II se recopilaron de la misma manera que para el cristal I. Solo para el cristal III, los datos de difracción de rayos X del estado fundamental se recopilaron inicialmente antes que los datos del intermedio K. La dosis de absorción de rayos X se estimó con el programa RADDOSE43. La dosis se estimó en 0,05 MGy por un conjunto de datos y 0,1 MGy en un total de dos conjuntos de datos. La dosis total es inferior al límite de dosis a 15 K de 0,15 MGy estimado en nuestro estudio previo25.

Todos los datos de difracción se procesaron con el programa XDS44. Al comienzo del análisis de la estructura, la estructura del estado fundamental se refinó para cada cristal utilizando 5ZIL como modelo inicial25. La acumulación del intermedio K se comprobó primero con el mapa de Fourier de diferencia Fo(K + bR) − Fo(bR) utilizando las fases de la estructura del estado fundamental. F (K) y σ(F (K)) se extrapolaron usando las ecuaciones45

donde f es la relación de fracción del intermedio K. El valor de f se determinó a partir de las características de forma de la porción de la retina en el mapa de omisión de Fo(K)−Fc(K) y los factores de temperatura de la retina después del refinamiento de los conjuntos de datos extrapolados con varios valores de f utilizando el programa CNS46. En los cálculos de refinamiento, solo se movieron las coordenadas de la retina y los residuos con densidades en el mapa de Fourier de diferencia Fo(K + bR) − Fo(bR). Las estructuras fueron corregidas con el programa COOT47. La estructura K del valor f más plausible se refinó posteriormente contra el conjunto de datos extrapolado con el programa SHELX48. La estructura K se usó en el refinamiento SHELX posterior contra F (K + bR), donde los estados K y fundamental se trataron como conformaciones dobles. En cuanto a la fracción de gemelos, el valor inicial se estimó con la prueba L49 con el programa CTRUNCATE en la suite de programas CCP450. La fracción gemela se optimizó a través de los cálculos de refinamiento para el estado fundamental y las estructuras K extrapoladas. Por otro lado, la fracción gemela para la estructura K + bR se optimizó solo en algunos pasos finales del refinamiento SHELX. Los datos entrelazados se procesan utilizando el método de Pratt et al. y Jameson en el programa SHELX51,52,53. La estructura refinada se comprobó con el programa MolProbity54. Todas las figuras moleculares se prepararon con el programa PyMOL55.

Todos los residuos, retina y 19 aguas en el canal de protones se seleccionaron como objetivos para los cálculos de QM/MM. Las coordenadas iniciales del estado K fueron extrapoladas de 7XJC determinadas en este estudio, mientras que las del estado bR fueron de 5ZIL. Los estados de protonación al pH de cristalización (5.6) se estimaron con el programa PROPKA56. Los átomos de hidrógeno se agregaron con los programas PDB2PQR57 y MAESTRO58. Las coordenadas de los átomos de H se optimizaron bajo el esquema QM/MM con el programa suite GAMESS (US)59. La región QM incluye Tyr57, Arg82, Asp85, Trp86, Thr89, Trp182, Tyr185, Pro186, Asp212, Lys216, retinal, W401, W402 y W406 (Fig. 9a complementaria). Los cálculos de QM se realizaron en el nivel M06-2X/6-31(d,p) como se recomienda para las rodopsinas que contienen retina60. La región MM fue tratada con el campo de fuerza CHARMM3661. Al principio, los átomos de H de las moléculas de agua se optimizaron con el cálculo de MM puro. A continuación, solo se optimizaron los átomos de H de la región QM mediante la fijación de los átomos que no son de H. Finalmente, se optimizaron todos los átomos de la región QM. Los valores rmsd entre la estructura cristalina y la estructura optimizada fueron 0,13 Å para el estado K y 0,07 Å para el estado fundamental, respectivamente, para los átomos que no son H de la región QM (Figura complementaria 9b, c). En cuanto a todos los átomos que no son H de las regiones QM y MM, estos valores fueron 0,33 Å y 0,27 Å. Las gráficas NCI del gradiente de densidad reducido se calcularon a partir de las densidades electrónicas DFT utilizando el programa NCIPLOT62. Los potenciales para los enlaces Cε−Nζ y Cδ−Cε se calcularon para CH2 = NH−CH2−CH2−CH3 libre con Psi4 usando HF/6-31 G*63,.

Se probaron más de 10 cristales en el experimento de difracción y se seleccionaron datos de tres cristales (Cristales I-III) para los análisis de estructura en función de la resolución. Las estructuras K y de estado fundamental de un cristal que proporciona las mejores resoluciones (Cristal I) se describen en el texto principal, mientras que las otras dos se proporcionan en los materiales complementarios. Los valores medios y las desviaciones estándar para los ángulos de torsión de la retina calculados a partir de las tres estructuras para cada uno se muestran como círculos huecos y barras de error (Fig. 2b, Fig. 5b y Fig. 6 complementaria).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas y los factores de estructura se han depositado en Protein Data Bank con los números de acceso 7XJC (para bR+K), 7XJD (para bR) y 7XJE (para K extrapolada). Los datos de origen de las cifras se pueden encontrar en Datos complementarios.

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Agradecemos a los Sres. N. Hasegawa e Y. Imai por su ayuda en este trabajo. También agradecemos al personal de la línea de luz en BL41XU de SPring-8 por su ayuda con los experimentos de recopilación de datos (Propuestas n.° 2018B2706, 2019B2718, 2021A2753 a KT). Este trabajo fue apoyado por la Fundación de la Universidad de Kyoto (para KT), la Fundación de Ciencias Takeda (para KT) y JSPS KAKENHI (No. JP 20H05220 para KT). H. salinarum se obtuvo del banco celular RIKEN BRC.

Departamento de Química, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Kyoto, Kyoto, Sakyo-ku, 606-8502, Japón

Shoun Taguchi, Satomi Niwa, Hoang-Anh Dao, Yoshihiro Tanaka, Ryota Takeda, Shuya Fukai y Kazuki Takeda

División de Biología Estructural, Instituto de Investigación de Radiación Sincrotrón de Japón (JASRI), 1-1-1 Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo, 679-5198, Japón

kazuya hasegawa

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KT supervisó el proyecto. ST y KT diseñaron los experimentos. Cristales preparados ST. ST, SN, KH y KT realizaron recopilaciones de datos. ST, SN, YT y KT realizaron análisis cristalográficos. H.-AD, RT y KT realizaron análisis químicos cuánticos. ST, SN, H.-AD, SF, KH y KT discutieron los resultados. ST y KT escribieron el borrador inicial y SN y H.-AD revisaron el borrador. Todos los autores hicieron comentarios sobre el borrador y dieron su consentimiento para la presentación de la versión final.

Correspondencia a Kazuki Takeda.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Michael F. Brown y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Janesh Kumar, Veronique van den Berghe y Gene Chong. Los informes de los revisores están disponibles.

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Taguchi, S., Niwa, S., Dao, HA. et al. Análisis detallado del retinal distorsionado y su interacción con los residuos circundantes en el intermedio K de la bacteriorrodopsina. Comun Biol 6, 190 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04554-2

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Recibido: 10 julio 2022

Aceptado: 03 febrero 2023

Publicado: 17 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04554-2

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