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Nature Plants volumen 9, páginas 157–168 (2023)Citar este artículo

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Una corrección del autor de este artículo se publicó el 20 de febrero de 2023

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Los últimos pasos de la respiración celular, un proceso metabólico esencial en las plantas, se llevan a cabo mediante la fosforilación oxidativa mitocondrial. Este proceso involucra una cadena de complejos de proteínas de membrana de múltiples subunidades (complejos I-V) que forman ensamblajes de orden superior llamados supercomplejos. Aunque los supercomplejos son la forma fisiológicamente más relevante de los complejos de fosforilación oxidativa, sus funciones y estructuras siguen siendo en su mayoría desconocidas. Aquí presentamos la estructura de microscopía electrónica criogénica del supercomplejo I + III2 de Vigna radiata (frijol mungo). La estructura contiene el complemento completo de subunidades del complejo I, incluida una subunidad específica de planta recientemente asignada. También muestra diferencias en el dominio de la peptidasa de procesamiento mitocondrial del complejo III2 en relación con un supercomplejo previamente determinado con el complejo IV. La interfase supercompleja, aunque recuerda a la de otros organismos, es específica de la planta, con una interfase principal que involucra el dominio de peptidasa de procesamiento mitocondrial del complejo III2 y sin participación del dominio puente del complejo I. La estructura del complejo I sugiere que el dominio puente establece el ángulo entre los dos brazos de la enzima, lo que limita los cambios conformacionales a gran escala. Además, los bucles catalíticos del complejo I y su respuesta en ensayos de activo a inactivo sugieren que, en V. radiata, el complejo en reposo adopta un estado no canónico y puede muestrear conformaciones de tipo abierto o inactivo incluso en presencia de sustrato. Este estudio amplía nuestra comprensión de las posibles conformaciones y el comportamiento del complejo I y el supercomplejo I + III2. Se necesitan más estudios del complejo I y sus supercomplejos en diversos organismos para determinar los mecanismos universales y específicos de clado de la respiración.

La respiración celular es un proceso metabólico esencial en las plantas. Los últimos pasos de la respiración se llevan a cabo por fosforilación oxidativa (OXPHOS) en la membrana mitocondrial interna (IMM). En su forma canónica, OXPHOS involucra cuatro complejos de proteínas de múltiples subunidades de la cadena de transporte de electrones (complejos I-IV, CI-CIV), así como la ATP sintasa mitocondrial (complejo V). Los complejos I-IV transfieren electrones del NADH o succinato al oxígeno molecular a través de los transportadores de electrones quinona y citocromo c y establecen un gradiente electroquímico de protones a través de la IMM. Este gradiente de protones luego es disipado por el complejo V, produciendo ATP1. Los complejos OXPHOS pueden existir de forma independiente, pero se ensamblan con mayor frecuencia en ensamblajes estequiométricos de orden superior llamados supercomplejos, cuyas funciones aún no están claras2,3,4,5,6,7. En plantas, entre el 50% y el 90% de IC se ha encontrado asociado con CIII2 (SC I + III2) después de la extracción con detergente del IMM y la electroforesis en gel nativo, lo que probablemente subestima el alcance de las asociaciones de supercomplejos in vivo8. Por lo tanto, para comprender completamente las funciones fisiológicas de CI, el principal punto de entrada de electrones en OXPHOS, debemos estudiarlo en el contexto de sus supercomplejos. El análisis bioquímico y estructural de SC I + III2 es un paso crucial para comprender los supercomplejos respiratorios en las plantas.

Recientemente, se han obtenido múltiples estructuras de microscopía electrónica criogénica (cryoEM) para CI de plantas o fragmentos de CI9,10,11. Además, están disponibles estructuras para SC I + III2 de Ovis aries (ovino) y Tetrahymena thermophila12,13. Si bien estas estructuras ayudan a nuestra comprensión de la planta SC I + III2, no son suficientes. Por ejemplo, todas las estructuras de la planta CI están incompletas, falta la subunidad NDUA11, así como la densidad de hélices transmembrana (TMH) en las subunidades centrales Nad5 y Nad6. Además, varias densidades han permanecido sin asignar, incluida la de una nueva subunidad putativa cuya identidad no se pudo determinar9,10,11. Además, las secuencias involucradas en la formación de SC I + III2 en O. aries y T. thermophila (por ejemplo, de NDUB4 y NDUB9) faltan en los homólogos de plantas, y existen diferencias sustanciales en las interfaces SC I + III2 entre ovino y T. .thermophila SC I+III2. Por lo tanto, estas estructuras no pueden usarse directamente para hacer predicciones sobre la(s) interfaz(es) SC de la planta. Además, aunque las reconstrucciones de la planta SC I + III2 están disponibles a partir de promedios de subtomogramas de Asparagus officinalis7 y microscopía electrónica de tinción negativa de Arabidopsis thaliana14, sus resoluciones son demasiado bajas para realizar evaluaciones detalladas.

En este artículo, presentamos una estructura de alta resolución de SC I + III2 de Vigna radiata (frijol mungo) de una preparación bioquímicamente activa. Esta estructura contiene el complemento completo de subunidades para la planta CI que incluye NDUA11 (B14.7), fragmentos previamente faltantes de Nad5 y Nad6, y una subunidad CI recién asignada (NDUP9). Además, CIII2 contiene una isoforma diferente de la subunidad α de la peptidasa de procesamiento mitocondrial (MPP) de la observada en CIII2 y SC III2 + IV aislados (ref. 15). CI y CIII2 interactúan en tres sitios que no involucran el dominio puente de CI. Contrariamente a una hipótesis previa del CI de A. thaliana (ref. 11), nuestro análisis sugiere que la apertura del complejo es más probable que se deba a la degradación de la muestra que a un proceso regulatorio. Además, un examen de la estructura a gran escala de CI, los bucles catalíticos y la respuesta activa a desactivada (A/D) sugiere que la conformación en reposo de V. radiata CI es un estado intermedio no canónico y que CI muestra estados similares tanto en el ausencia y presencia de sustrato.

Aislamos mitocondrias de hipocotilos de frijol mungo etiolados. Luego extrajimos complejos de proteínas de las membranas mitocondriales usando el detergente suave digitonina y los estabilizamos usando polímeros anfipáticos (Datos extendidos Fig. 1a, b). Usando un gradiente de sacarosa, purificamos parcialmente complejos y supercomplejos respiratorios (Datos extendidos Fig. 1c, d). Agrupamos, intercambiamos tampones y concentramos las fracciones que contenían SC I + III2 (datos extendidos Fig. 1c, d) y usamos esta muestra parcialmente purificada para transferir rejillas crioEM, como se describió anteriormente9,13,15. Purificamos aún más SC I + III2 usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Datos extendidos Fig. 1e, f). La muestra bioquímica final mostró la actividad oxidorreductasa de NADH-cyt c esperada, que fue inhibida por los inhibidores de CI y CIII2 piericidina A y antimicina A, respectivamente (Fig. 1a).

a, actividad de NADH-cyt c oxidorreductasa de SC I + III2 aislado estabilizado con anfipol en ausencia o presencia de inhibidores de CI o CIII2 (piericidina A 20 μM y antimicina A 1 μM, respectivamente). Los valores son promedios de tres o cuatro mediciones independientes de una sola muestra purificada de SC I + III2; las barras de error muestran el coeficiente de variación calculado como la suma de los coeficientes de variación de cada valor determinado experimentalmente (longitud del camino, coeficiente de extinción y actividad) multiplicado por el promedio. b, mapa de densidad CryoEM de SC I + III2 coloreado por subunidad. Las ubicaciones aproximadas de la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana (IMS) se muestran con líneas negras. c, Mejora del modelo atómico frente a estructuras previamente disponibles de planta CI. Subunidades mejoradas o nuevas mostradas en caricaturas de colores sobre una superficie semitransparente de CI. Cter, C-terminal. d,e, SC I + III2 mostrado desde la matriz (d) o el plano de la membrana (e). Complejo I (CI) en superficie azul, complejo III2 (CIII2) en superficie verde.

Nuestro procesamiento de imágenes cryoEM dio como resultado dos reconstrucciones iniciales de SC I + III2 que contenían el complemento completo de subunidades (SC I + III2 'en puente') a una resolución de 3,3 Å y 3,6 Å (clase 1 y clase 2, respectivamente) (Datos extendidos Fig. 2 y tablas de datos ampliados 1 y 2). El análisis de variabilidad tridimensional (3DVA) de todas las partículas SC I + III2 con puente demostró que la mayor parte de la variabilidad en las partículas con puente provino de la interfaz flexible entre CI y CIII2 (Películas complementarias 1 y 2), lo que resultó en un mapa general de menor calidad para CIII2 en ambas clases (Datos extendidos Fig. 2). Para superar la flexibilidad inherente de las partículas, realizamos refinamientos enfocados en las partículas puenteadas SC I + III2 clase 1 usando máscaras alrededor del dominio puente de CI, el 'talón' de CI, el módulo N de CI, el módulo de bomba distal (Pd) de CI y CIII2 ( Datos extendidos Fig. 3 y Tabla de datos extendidos 1). Se logró una mejora adicional en la calidad del mapa CIII2 mediante el refinamiento posterior centrado en los dominios MPP (Datos extendidos Fig. 3 y Tabla de datos extendidos 1). Estos mapas refinados enfocados se combinaron en un mapa compuesto con una resolución nominal de 3.2 a 3.6 Å (Fig. 1b, datos extendidos, figura 3 y datos extendidos, tabla 1). Además de las clases con puente, se identificaron clases menos pobladas para SC I + III2 sin el puente de ferredoxina y otras subunidades (SC I + III2 'sin puente') y solo para IC (datos extendidos, figura 2 y datos extendidos, tabla 2). ). Las partículas sin puente podrían clasificarse en cuatro clases, que se analizan más adelante. La reconstrucción de CI aislado carecía de una densidad clara para el puente, NDUA11 y TMH en Nad4-Nad6, y mostraba una densidad deficiente para el módulo de Pd, en consonancia con las estructuras de CI de planta publicadas previamente (refs. 10, 11). Esto sugiere que, en las plantas, puede ser necesario CIII2 para estabilizar el CI intacto después de la extracción de la membrana. Se ha estudiado en mamíferos16 cómo el ensamblaje y la integridad de cada complejo pueden afectar al otro, pero queda por investigar a fondo en las plantas.

Construimos el modelo atómico para V. radiata SC I + III2 (Fig. 1b-e) sobre la base de estructuras publicadas previamente de plantas CI y CIII2 (refs. 9, 11, 15). La densidad mejorada del mapa en relación con las reconstrucciones anteriores para el fragmento CI de V. radiata y CIII2 nos permitió determinar varios sitios de edición de ARN C a U adicionales en Nad1, Nad2, Nad3, Nad4, Nad4L, Nad5, Nad6, NDUS2 y NDUS3 (refs. 9, 15, 17) (Tabla de datos ampliada 3). El mapa SC I + III2 también contenía densidad para subunidades o regiones de subunidades en la interfaz entre CI y CIII2 que antes faltaban en otras estructuras de CI. Estos fueron la subunidad accesoria NDUA11 (B14.7), el extremo C de la subunidad central Nad5, la cuarta hélice transmembrana (TMH4) de la subunidad central Nad6 y el bucle entre TMH3 y TMH4 de Nad6 (Fig. 1c y Datos extendidos Fig. 4 ). Esto confirmó que NDUA11 es una subunidad de CI de buena fe en las plantas y estableció que el extremo C de Nad5 contiene dos TMH, como en la levadura18. Las posiciones de los bucles TMH4 y TMH3-4 de Nad6 tienen implicaciones funcionales que se analizan a continuación. Además, el mapa contenía una densidad extendida en forma de L para una subunidad en las cercanías de NDUA11 que permaneció sin identificar en las reconstrucciones anteriores de CI de la planta9,10,11. Esta densidad en forma de L se extiende hacia la interfaz entre CI y CIII2, proporcionando contactos entre complejos que no se ven en otras especies (Fig. 1c). Usando la densidad para obtener una secuencia de aminoácidos preliminar seguida de una búsqueda BLAST, pudimos asignar la subunidad como el producto del gen LOC106767179 de V. radiata (homólogo de A. thaliana At1g67785). Esto corresponde a un candidato a subunidad CI según lo determinado por estudios de espectrometría de masas19,20,21 que inicialmente se asignó erróneamente como NDUB5 (ref. 22) y luego se renombró como P4 (ref. 23). Sin embargo, dado que el alga Chlamydomonas reinhardtii y Polytomella sp. contienen las subunidades P4–P8 del complejo I establecido (refs. 11, 24), para evitar confusiones proponemos llamar a esta subunidad NDUP9. Esta subunidad parece ser específica de la planta, ya que las búsquedas estándar de BLAST arrojaron solo especies de plantas. En general, este mapa SC I + III2 proporciona el complemento completo de las subunidades CI de la planta (14 centrales y 34 accesorias; Tabla de datos ampliados 3).

El mapa SC I + III2 también reveló diferencias en el dominio MPP de CIII2 en comparación con las estructuras previamente disponibles del supercomplejo III2 + IV (SC III2 + IV) y CIII2 solo de V. radiata. Las plantas contienen múltiples isoformas de MPP-α (Datos extendidos Fig. 5a). Previamente determinamos que en SC III2+IV ambas subunidades MPP-α corresponden al gen LOC106774328 (ref. 15). En contraste, en SC I + III2, la subunidad MPP-α en el protómero CIII2 más cercana a CI era una isoforma diferente (correspondiente al gen LOC106765382), como lo revela el mejor ajuste de esta proteína a la densidad de SC I + III2 ( Datos extendidos Fig. 5b). Para MPP-α en el otro protómero de SC I + III2, la densidad es ambigua, con algunas posiciones que se ajustan más a la secuencia LOC106765382 y algunas posiciones que se ajustan más a la secuencia LOC106774328. Esto sugiere que la densidad podría representar el promedio de una población mixta, o que las bases de datos pueden estar mal anotadas. Las principales diferencias entre las isoformas se encuentran en el extremo N, incluida una región corta que interactúa con CI (ver más abajo). Queda por explorar la relevancia funcional de estas diferencias en MPP-α. También observamos diferencias en MPP-β. Si bien las isoformas de MPP-β eran las mismas que las de SC III2 + IV, la hélice que contenía el glutamato catalítico (Glu217) estaba parcialmente desordenada en ambos protómeros en SC I + III2 (Datos extendidos Fig. 5d, e). Esto conduce a una incapacidad para coordinar el Zn2+ catalítico (datos extendidos, Fig. 5d, e), lo que haría que el dominio MPP no fuera funcional. Queda por determinar si esta pérdida es una consecuencia biológicamente relevante de la formación de SC I + III2. Alternativamente, la pérdida de Zn2+ podría ser una consecuencia de nuestro procedimiento de purificación, que fue ligeramente diferente del utilizado para obtener la muestra SC III2 + IV en la que se observó Zn2+ en los sitios activos de MPP15. Será interesante comparar estos hallazgos en V. radiata SC I + III2 con los de otras especies de plantas.

El mapa SC I + III2 de frijol mungo mostró tres interfaces entre CI y CIII2: (1) un sitio matriz formado entre NDUB9 (CI), MPP-β (CIII2) y MPP-α (CIII2), (2) un sitio IMS formado entre NDUP9 (CI), NDUA11 (CI) y QCR6 (CIII2) y (3) un sitio de membrana entre NDUA11 (CI) y QCR8 (CIII2) (Fig. 2a-e). A diferencia del SC I + III2 de T. thermophila, donde el dominio del puente CI proporciona una interfaz SC extensa13, el dominio del puente CI de V. radiata no participó directamente en la formación de este supercomplejo (Datos extendidos Fig. 6a,b). El dominio MPP de CIII2 proporcionó la interfaz más grande, principalmente a través de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas entre MPP-β y NDUB9 (Fig. 2c). MPP-α también interactúa con NDUB9 a través de tres aminoácidos en la extensión N-terminal de MPP-α, dos de los cuales difieren entre las isoformas de MPP-α. Al comparar la extensión N-terminal de MPP-α de la estructura SC I + III2 (LOC106765382) con la de SC III2 + IV (LOC106774328), observamos que los bucles ocupan aproximadamente la misma posición (Datos extendidos Fig. 5c). Además, el residuo de aspartato que se posiciona para formar un puente salino con B9-Arg64 se conserva en ambas isoformas de MPP-α. Dada la similitud estructural, la conservación del aspartato y la mínima contribución de MPP-α a esta interfaz, es poco probable que este bucle de MPP-α sea suficiente para regular diferencialmente la formación de SC I + III2 versus SC III2 + IV. Sin embargo, la hipótesis de que CIII2 con diferentes isoformas de MPP-α se incorpora selectivamente en diferentes supercomplejos de CIII2 queda por probar experimentalmente. En el IMS, NDUP9 y NDUA11 contactaron con QCR6 (Fig. 2d). Mientras que NDUP9 y QCR6 mostraron principalmente interacciones hidrofóbicas, aquellas entre QCR6 y NDUA11 fueron de naturaleza más electrostática. Por último, el sitio de la membrana era una pequeña interfaz de un par de residuos en NDUA11 y QCR8 (Fig. 2e). Al igual que en las interacciones SC I + III2 de O. aries y T. thermophila, estos tres sitios en V. radiata se vincularon desde el IMS a la matriz a través de la participación de QCR8 en la lámina β de anclaje de MPP-β.

a, b, V. radiata SC I + III2 matriz (a), interfaces de membrana y espacio intermembrana (IMS) (b). Las subunidades que interactúan se muestran como dibujos animados de colores sobre la superficie semitransparente del complejo I (CI) (azul) o la superficie del complejo III2 (verde). El recuadro en b muestra la interfaz vista desde el IMS. c – e, detalles de interacción de V. radiata para interfaces de matriz (c), IMS (d) y membrana (e). Las subunidades se muestran como dibujos animados de colores con residuos clave como barras coloreadas por átomo. Algunos elementos estructurales están ocultos para mayor claridad.

Aunque las interfaces SC I + III2 del frijol mungo recordaban a las observadas en O. aries y T. thermophila (por ejemplo, involucrando NDUB9, NDUA11 y QCR8 en los tres organismos), las interacciones específicas de proteínas y aminoácidos fueron diferentes (Datos extendidos Fig. 6c-h). Las interacciones SC a través de NDUP9 parecen ser específicas de la planta. Además, las superposiciones de V. radiata, T. thermophila y O. aries SC I + III2 mostraron que el ángulo de aproximación entre CI y CIII2 difería entre organismos, como se observa en los promedios del subtomograma7. Una comparación de las interacciones y la orientación de CI:CIII2 con otras especies de plantas determinará si las interfaces observadas aquí son comunes entre las familias de plantas.

En varios organismos, se ha visto que CI adopta múltiples conformaciones basadas en la bisagra entre su membrana y los brazos periféricos18,25,26,27,28. Se han observado conformaciones análogas para CI en el mamífero SC I + III2, donde puede adoptar un estado 'cerrado' distinto y un conjunto de estados 'abiertos'12. Estos cambios a gran escala van acompañados de cambios conformacionales en los bucles en la vecindad del sitio de unión de la quinona (Nad1 TMH5-6, bucle NDUFS2 β1-2 y bucle NDUFS7 α1-2 y α2-β1) y en la interfaz entre los CI. brazos (Nad3 TMH2-3 y Nad6 TMH3-4) (refs. 18,25,26,27,28). Además, en algunos organismos CI puede sufrir una transición A/D29,30,31. Esta es una transición fuera de la ruta que coloca a CI en un estado catalíticamente incompetente cuando está en ausencia de sustrato, lo que protege contra la lesión por reperfusión isquémica en mamíferos30,31,32,33,34. Dado que la transición A/D también ocurre a través de cambios conformacionales, sigue siendo controvertido si las conformaciones abiertas y cerradas de CI corresponden a estados intermedios en el ciclo catalítico de CI oa sus estados activo e inactivo28,35,36,37. En las plantas, aún no se ha investigado la presencia de la transición A/D. Por lo tanto, examinamos las conformaciones a gran escala y en bucle del CI de V. radiata en la estructura SC I + III2, así como la capacidad del CI para experimentar la transición A/D en las membranas mitocondriales.

Nuestro procesamiento de imágenes cryoEM identificó seis clases tridimensionales distintas: dos clases principales de SC I + III2 con puente descritas anteriormente (~72 % de partículas supercomplejas) y cuatro clases menores sin puente (~28 % de partículas supercomplejas) que varían en conformación y composición (Fig. 3 y Datos extendidos Fig. 2). Las clases en puente mostraron solo una pequeña diferencia en sus conformaciones generales de CI (Fig. 3a, b y Películas de datos extendidos 1 y 2). En contraste, las clases sin puente mostraron un aumento progresivo en el ángulo entre los brazos periféricos y de membrana de CI y una disminución en la curvatura del brazo de membrana de CI, tanto entre ellos como en comparación con las clases con puente (Fig. 3c-f) . Las clases sin puente no solo perdieron las subunidades del dominio del puente (NDUFX, NDUA6 y NDUAB1-α), sino que también perdieron progresivamente la densidad de las subunidades o segmentos de subunidades en la interfaz entre CI y CIII2 (subunidad NDUA11, terminal C de NDUP9, dos C de Nad5). -hélices terminales, TMH4 de Nad6, bucle TMH3-4 de Nad6, terminal C de QCR6 y hélice transmembrana de QCR8) (Fig. 3g). Dada la importancia de algunas de estas subunidades para la catálisis, es poco probable que las clases SC I + III2 sin puente sean funcionales, o que la pérdida del puente sea un proceso regulador como se sugirió anteriormente para A. thaliana CI (ref. 11 ). En nuestra opinión, es más probable que las clases sin puente sean el producto de una degradación progresiva durante la purificación de la muestra y/o la preparación de la rejilla cryoEM.

a–c, Clases con puente (a,b) y sin puente de SC I + III2 vistas desde el lado (a) o la matriz (b,c). Puente clase 1 en gris, clase 2 en gris más claro. Clase 1 a clase 4 sin puente en tonos de azul progresivamente más claros. El asterisco indica la presencia de NDUA11 en la clase 1 sin puente. d–f, diferencias entre las clases con puente y sin puente de SC I + III2 vistas desde el lado (d), matriz (e) o la parte posterior de CI desde el plano de la membrana (f). Se muestra SC I + III2 clase 1 con puente en gris alineado con clase 4 sin puente en azul claro. Las rotaciones se indican con respecto a d. La apertura del brazo periférico y el enderezamiento del brazo de la membrana se representan con líneas y flechas. g, subunidades CI y CIII2 y fragmentos que se pierden en la clase 4 sin puente que se muestran en dibujos animados de colores sobre la superficie azul claro del mapa de clase 4. h,i, Comparación de V. radiata puente clase 1 (gris) y la clase SC I + III2 más abierta de O. aries (PDB: 6QC4) (ref. 12) (naranja claro) visto desde la matriz (h) o la espalda (yo). Las posiciones del complejo III2 (CIII2) y la subunidad NDUFV1 (V1) de CI se muestran a modo de orientación.

También comparamos el ángulo entre los brazos de CI en O. aries y V. radiata SC I + III2. Aunque el SC I + III2 con puente de V. radiata estaba más cerrado (ángulo más pequeño entre los brazos) que el SC I + III2 sin puente, aún estaba más abierto que el SC I + III2 más abierto de O. aries (Fig. 3h, i ). Por lo tanto, no está claro desde el ángulo solo si se debe considerar que el puente SC I + III2 de V. radiata tiene IC en un estado 'abierto' o 'cerrado'.

Para obtener más claridad sobre el estado de CI en SC I + III2 de V. radiata, comparamos las características de sus bucles de interfaz y quinona con las de CI en estados observados previamente, por ejemplo, clases abiertas y cerradas en O. aries26, el estado inactivo en Mus musculus25,27 y Yarrowia lipolytica CI en estado de recambio y inactivo18.

En términos generales, se ha visto en múltiples organismos que los bucles se ordenan en los estados cerrados o de rotación y se desordenan en los estados abiertos e inactivos. Sin embargo, los bucles de V. radiata no coincidieron completamente con ningún estado observado previamente (Fig. 4a-e y Datos extendidos Fig. 7a, b). En la región de unión a quinona, el bucle Nad1 TMH5-6 de V. radiata se ordenó en lo que se asemejaba a la conformación 'abajo' de la clase cerrada de CI ovino, que también se observa en los estados inactivos y de recambio de levadura (Fig. 4a). Sin embargo, no todos los residuos clave de glutamato (V. radiata Nad1-Glu207, Glu209 y Glu219) estaban dentro de la distancia adecuada para formar puentes salinos con residuos clave de arginina en S7 (V. radiata S7 Arg111 y Arg115) como se ve en la levadura ovina cerrada. facturación y otras estructuras18,26,38. El bucle Nad1 TMH5-6 de V. radiata tampoco era equivalente al bucle ordenado en el estado 'abierto-listo' recientemente observado del CI de Escherichia coli37, ya que el Nad1-Glu211 de V. radiata apuntaba en dirección opuesta al bucle S2 β1-2. Además, el residuo clave S7 Arg111 estaba en una posición 'sin voltear' similar al ovino cerrado y la levadura en estado inactivo o inactivo, pero con una cadena β para los residuos S7-Pro81-Leu86 típicos del ovino abierto y los estados inactivos de levadura. (Figura 4b). El bucle S2 β1-2 estaba desordenado, de acuerdo con la clase abierta ovina y el estado inactivo murino, pero no con el estado inactivo de levadura (Fig. 4c). En cuanto a los bucles en la interfaz entre los brazos de CI, el bucle Nad3 TMH1-2 estaba desordenado en toda su longitud, asemejándose al estado inactivo murino (Fig. 4d). Se ordenó el bucle Nad6 TMH3-4 de V. radiata, pero el Nad6 TMH3 mostró la protuberancia π característica que se observa en las estructuras de mamíferos abiertas y desactivadas, así como en las estructuras de levadura desactivadas y rotativas (Fig. 4e). Es importante destacar que el TMH4 de V. radiata Nad6 estaba en una posición 'distal' en la interfaz entre el TMH1 de Nad4L y el TMH16 de Nad5 (Fig. 4f). Esto está a ~14 Å de la posición de Nad6 TMH4 en las clases abiertas/cerradas ovinas, a ~16 Å del estado inactivo murino y a ~25 Å del Nad6 TMH4 inclinado en el estado 'activo' ovino26 (que carece de densidad para NDUFA11 y ND5 y, por tanto, es más similar a lo que se ha denominado IC de 'estado 3', es decir, en etapas iniciales de degradación28). Más bien, la posición de V. radiata Nad6 TMH4 se parecía más a la de Thermus thermophilus con o sin sustratos39,40, así como a la de E. coli en estructuras abiertas, listas para abrir o cerradas37, con similitudes con la estructura de Tetrahymena thermophila13 y la Y. lipolytica estado inactivo18 (Fig. 4f).

a–e, Comparación de especies de bucles de CI asociados con catálisis, que muestra el modelo de V. radiata y la densidad asociada (caricatura verde, mapa transparente) (izquierda) y el modelo de la estructura a la que más se parece, coloreada por estructura (derecha). a, bucle Nad1 TMH5-6; O. aries nativo cerrado (naranja claro), PDB: 6ZKO26. b, bucle NDUFS7 α1-2 (izquierda) y bucle α2-β1 (derecha). El residuo clave de arginina (R) y la cadena β están marcados; Clase cerrada nativa de O. aries con arginina 'sin voltear' en el bucle β1-2, cadena β para el bucle α2-β1 (naranja claro, izquierda), PDB: 6ZKO26 y nativa abierta de O. aries con arginina invertida y cadena β ( amarillo, derecha), PDB: 6ZKP26. c, bucle NDUFS2 β1-2; M. musculus inactivo (naranja oscuro), PDB: 6G72 (ref. 25). d, bucle Nad3 TMH1-2; M. musculus inactivo (naranja oscuro), PDB: 6G72 (ref. 25). e, bucle Nad6 TMH3-4; Thermus thermophilus nativo (verde azulado claro), PDB: 4HEA64. f, Posición de Nad6 TMH4 a través de organismos y condiciones. Estructuras alineadas por Nad6. V. radiata Nad5 TMH16 y Nad4L TMH1 mostrados para orientación (caricatura gris). Estructura: V. radiata (verde, este estudio), T. thermophilus nativa (verde azulado claro, PDB: 4HEA64), Tetrahymena thermophila nativa (crema, PDB: 7TGH13), Yarrowia lipolytica desactivada (marrón, PDB: 7O71 (ref. 18) ), O. aries nativo cerrado (naranja claro, PDB: 6ZKO26), O. aries nativo abierto (amarillo, PDB: 6ZKP26), M. musculus inactivo (rojo, PDB: 6G72 (ref. 25)), O. aries ' desactivado' (azul, PDB: 6KZS26). g,h, transición A/D en las membranas mitocondriales de S. scrofa (g) y V. radiata (h). Las membranas se trataron con NEM 2 mM aisladas (naranja, verde) o después de la desactivación térmica (naranja claro, verde claro), en presencia o ausencia de preactivación con NADH 5 μM (S. scrofa) o dNADH 5 μM (V radiata). Los valores son el porcentaje de actividades promedio (NEM/no NEM) determinado a partir de cuatro a diez mediciones independientes en muestras individuales de membranas mitocondriales aisladas de S. scrofa o V. radiata que se muestran en Datos extendidos Fig. 7. Las barras de error equivalen al coeficiente de variación para el ratio calculado como la suma del coeficiente de variación de las tasas individuales multiplicado por el valor del ratio. La significación estadística de la diferencia entre las proporciones se determinó utilizando una prueba z de dos colas. *P < 0,05 (P = 0,02 para S. scrofa desactivado). NS, no estadísticamente significativo (P > 0,05).

Estos hallazgos indican que las conformaciones de bucle en nuestra estructura de V. radiata no se pueden correlacionar claramente con los estados abiertos o cerrados de CI descritos anteriormente, ni son completamente equivalentes al estado inactivo en mamíferos o levaduras. Sin embargo, la presencia de la protuberancia π en el TMH3 de Nad6, que rota los residuos hidrofóbicos en el eje hidrofílico de CI e interrumpe el cable de agua que se cree que se requiere para el bombeo de protones26,35, sugiere que nuestra estructura contiene CI en un estado de reposo.

Hasta donde sabemos, la existencia de la transición A/D no se ha investigado previamente en las plantas. Por lo tanto, probamos la capacidad de V. radiata CI para experimentar la transición A/D utilizando un ensayo estándar con membranas mitocondriales aisladas30,31,41,42. En este ensayo, el CI se desactiva mediante la incubación de las membranas a 37 °C en ausencia de sustrato, lo que provoca la alteración del sitio activo y la posible apertura a gran escala de la estructura27. Luego, se agrega N-etilmaleimida (NEM) para 'atrapar' el CI en la conformación desactivada mediante la modificación de una cisteína conservada en el bucle TMH1-2 de Nad3 (Cys44 en V. radiata), que está expuesto en el estado inactivo pero inaccesible en el activo estado. Por lo tanto, la modificación de NEM evita la reactivación de CI, lo que lleva a una reducción en la tasa de oxidación de NADH observada. Los efectos perjudiciales de NEM se pueden minimizar activando previamente el complejo con una concentración baja de NADH (sustrato) antes de la incubación con NEM.

Comparamos la respuesta de V. radiata al ensayo A/D con la de membranas mitocondriales de mamíferos aisladas de Sus scrofa (cerdo), cuyo CI se sabe que experimenta una transición A/D 'clásica'30. Como era de esperar, la exposición de la membrana mitocondrial porcina a NEM 2 mM disminuyó las tasas de CI, tanto para las membranas desactivadas térmicamente como para las 'como aisladas' (no desactivadas). El efecto NEM se rescató parcialmente mediante preactivación con NADH 5 μM en ambos casos. Además, el efecto inhibitorio de NEM fue mayor en las membranas desactivadas que en las membranas no desactivadas, como se esperaba (Fig. 4g y Datos extendidos, Fig. 7c).

Realizamos ensayos similares con membranas mitocondriales de V. radiata. Para evitar los efectos de las deshidrogenasas NADH alternativas mitocondriales de las plantas, utilizamos el análogo de NADH deaminoNADH (dNADH), que puede ser utilizado como sustrato por CI pero no por las deshidrogenasas alternativas43,44,45,46 (Datos extendidos Fig. 7d) . Aunque las membranas de V. radiata también eran susceptibles a NEM, su susceptibilidad no mostró cambios importantes tras la desactivación térmica (Fig. 4h y Datos extendidos Fig. 7d). Esto es coherente con la incubación sin sustratos a una temperatura elevada que no conduce a una mayor exposición del bucle THM1-2 de Nad3. Además, la susceptibilidad de V. radiata a NEM no cambió con la preactivación con dNADH 5 μM (Fig. 4h y Datos extendidos Fig. 7d). Es decir, la planta CI era igualmente susceptible a NEM, ya sea que la enzima se hubiera cambiado recientemente o no. Esto sugiere que la CI de la planta no entra en estados bioquímicamente distintos equivalentes a los estados A y D observados en la CI de los mamíferos, posiblemente debido a la presencia del dominio puente.

En general, el IC de V. radiata en SC I + III2 exhibió características no canónicas en términos de su estructura a gran escala, sus bucles catalíticos y su comportamiento en el ensayo A/D estándar.

Aquí presentamos la estructura cryoEM de SC I + III2 activo purificado de mitocondrias de V. radiata, junto con un examen funcional de la transición A/D en membranas mitocondriales aisladas.

El conjunto SC I + III2 protegió varias subunidades CI en la interfaz con CIII2. Por lo tanto, nuestra reconstrucción contenía la estructura completa de CI, incluida la subunidad accesoria NDUA11, TMH adicionales de las subunidades centrales Nad5 y Nad6, así como una subunidad de CI recién asignada, probablemente específica de la planta, NDUP9 (Fig. 1 y Datos extendidos Figs. 1– 3). Nuestra estructura también contenía una isoforma diferente de MPP-α en un protómero CIII2 en relación con la observada en SC III2 + IV (correspondiente a los genes LOC106765382 y LOC106774328, respectivamente; Datos ampliados Fig. 5). Esto implica que los supercomplejos CIII2 pueden ensamblarse de manera diferencial dependiendo de la isoforma MPP-α presente. Además, la falta de Zn2+ catalítico en ambas subunidades MPP-β sugiere que la función MPP de CIII2 no está activa cuando CIII2 se ensambla en SC I + III2. Hasta donde sabemos, no se han investigado las posibles diferencias funcionales de las isoformas MPP-α o MPP-β. En la patata, MPP-α1 se expresa más a nivel de ARN mensajero en varios tejidos de plantas maduras que MPP-α2, sin una variación sustancial específica de tejido en condiciones estándar47,48. Además, en A. thaliana, MPP-α2 (At3g16480) se dirige de forma dual a los cloroplastos y las mitocondrias48. Los alineamientos de secuencia estándar entre las isoformas de MPP-α de V. radiata y A. thaliana no revelaron de manera concluyente las relaciones de homología entre las isoformas. Las hipótesis de que las isoformas de MPP clasifican CIII2 en diferentes supercomplejos, que el MPP de CIII2 es activo en SC III2 + IV pero no en SC I + III2 y que los supercomplejos se ensamblan de manera diferencial en ciertos tejidos, tensiones o etapas de desarrollo aún deben probarse experimentalmente.

Como se esperaba de las comparaciones tomográficas de baja resolución7 y las alineaciones de secuencias, los detalles de la interfaz SC I + III2 son específicos de la planta (Fig. 2). La interfaz principal en V. radiata está en el lado de la matriz, entre MPP-β y NDUFB9, lo que podría restringir la flexibilidad y la función del dominio MPP. Una característica clave de la interfaz SC I + III2 en las plantas es la participación de la nueva subunidad CI, NDUP9. El análisis funcional de los mutantes NDUP9 iluminará los roles fisiológicos de SC I + III2 y la formación de supercompejos en general, como se ha comenzado a investigar con los mutantes NDUFX y NDUA1149.

A pesar de los detalles específicos, la amplia disposición de los complejos en SC I + III2 se conserva entre plantas, mamíferos12, alveolados13 y levaduras7. Esto sugiere que esta disposición supercompleja proporciona ventajas evolutivas, potencialmente a través de la estabilización de subunidades o mediante el equilibrio del flujo de electrones para limitar la formación de especies reactivas de oxígeno. Por ejemplo, al garantizar que CI y CIII2 estén cerca uno del otro, la formación de SC I + III2 podría evitar la generación de diferencias locales en la proporción de quinona a quinol, especialmente entre las crestas mitocondriales, que de otro modo podrían promover la producción de especies reactivas de oxígeno en regiones donde la reserva está sobre reducida50.

Al igual que en otros organismos, nuestro procesamiento cryoEM produjo múltiples clases para SC I + III2 (refs. 11, 12, 25, 26). Sin embargo, en lugar de diferir principalmente en el ángulo de CI, también diferían en la integridad de la composición de CI y una mayor flexibilidad de CIII2 (Fig. 3 y Datos extendidos Fig. 2). Cuatro de las seis clases mostraron pérdida del dominio del puente (SC I + III2 'sin puente'). Esto estuvo acompañado de pérdida o alteración de las subunidades accesorias y centrales (NDUA11 perdida; NDUP9, QCR6 y QCR8, Nad5 y Nad6 parcialmente desordenadas), así como aumentos en el ángulo entre los brazos de CI y entre CI y CIII2. Las dos clases 'en puente' contenían una buena densidad para el dominio del puente y diferían solo ligeramente en el ángulo entre los brazos del IC. Estos hallazgos implican que el puente restringe la flexibilidad de la CI en las plantas, lo que limita el ángulo y el rango de movimiento de los brazos y ayuda a mantener la integridad de la composición de la enzima. Además, NDUA11, el extremo C-terminal de Nad5 y el TMH4 de Nad6 son críticos para la catálisis, y se ha observado su pérdida y aumento de flexibilidad en estructuras de CI de mamíferos en las etapas iniciales de degradación ("clase/estado 3") (refs. 25, 28). , 51, 52). Por lo tanto, desde nuestro punto de vista, la pérdida del puente y las subunidades asociadas y el aumento concomitante en el ángulo de CI en las clases sin puente reflejan más probablemente una degradación progresiva de la muestra durante la preparación que un mecanismo regulador para CI (ref. 11). Nuestra opinión está en línea con análisis funcionales recientes de líneas knockout de A. thaliana de NDUFX (una de las subunidades puente)49, que carecen de SC I + III2. A pesar de la falta del puente y de SC I + III2, estos mutantes no muestran defectos de crecimiento o desarrollo en condiciones estándar, lo que sería de esperar si el dominio del puente regulara la actividad de CI. Además, dado que los mutantes NDUFX acumulan parcialmente CI en la etapa intermedia de ensamblaje de CI* en lugar de en supercomplejos sin puente, también es poco probable que nuestras partículas sin puente se hayan originado a partir de defectos de ensamblaje49. En cambio, el puente de CI probablemente juega un papel estructural en mantener los brazos de CI en un estado permisivo para la formación de SC I + III249. Se necesitan más experimentos sobre el papel del puente en el ensamblaje de CI y la formación de supercomplejos.

Aunque las clases con puente parecían 'cerradas' (ángulo más pequeño) en relación con las clases sin puente, eran más abiertas que la clase SC I + III2 de mamíferos más abierta (Fig. 3). Esto implica que las denominaciones abiertas y cerradas y los ángulos son relativos, y respalda la opinión de que la apertura y el cierre de la estructura pueden reflejar simplemente la flexibilidad inherente específica del organismo del complejo38. El hecho de que el dominio del puente en las plantas limite la flexibilidad conformacional de CI y que la planta CI no pueda adoptar más estados abiertos sin perder el puente sugiere que los cambios en el ángulo entre los brazos no son parte del mecanismo catalítico conservado de CI. Además, nuestra estructura muestra que la apertura y el cierre del ángulo no son necesarios para ordenar o desordenar los bucles catalíticamente relevantes en las plantas. Esto está en línea con las observaciones del CI de T. thermophila (ref. 13), que también contiene un dominio puente, así como del CI de Chaetomium thermophilum (ref. 38), que no contiene un puente de ferredoxina pero tiene un puente adicional. interacciones a través de una extensión en NDUA5. También concuerda con estructuras recientes de E. coli CI en diferentes condiciones, que muestran diferencias en la rotación de la PA pero no en el ángulo entre los brazos37. No obstante, queda por examinar si el ángulo del IC de V. radiata (así como el de T. thermophila y C. thermophilum) cambia en condiciones de recambio. Independientemente, es cada vez más claro que las distinciones entre los estados de IC deben centrarse en la conformación de los bucles y hélices relevantes en lugar de los ángulos a gran escala entre los brazos, como sugirieron recientemente otros37,38.

Nuestro examen de los bucles catalíticos de CI reveló que el CI de V. radiata (aislado en ausencia de sustratos) contenía una mezcla de características vistas previamente en estados abierto/cerrado y de rotación/nativo/desactivado sin alinearse claramente con ningún estado único (Fig. 4 y Datos extendidos Fig. 7). El sitio de unión a quinona apareció en un estado semiordenado con el bucle Nad1 TMH1-2 en una posición hacia abajo. Sin embargo, solo un glutamato (Glu219) en Nad1 TMH1-2 estaba dentro de la distancia de puente salino a los residuos clave de arginina en el bucle S7 β1-2 (Arg115), aunque Arg111 miraba hacia Nad1 TMH1-2. El resto de los bucles del sitio de quinona (bucle S7 α2-β1 y bucle S2 α1-2) recordaban a IC en estado inactivo y abierto25,26. Entre los bucles de 'interfaz', el bucle Nad1 TMH1-2 altamente desordenado recordaba el estado murino inactivo y Nad6 contenía un abultamiento π típico de las estructuras desactivadas pero también unidas al sustrato18,25,26. La posición de TMH4 de Nad6 era 'distal', es decir, metida entre Nad5 y Nad4L, que recuerda a estructuras de no mamíferos en múltiples condiciones, y muy diferente de la posición en estructuras desactivadas de mamíferos13,18,25,26,37,39 . En conjunto, esto sugiere que la conformación en reposo de la enzima se encuentra en un estado "intermedio" en relación con los estados observados previamente en otros organismos.

La configuración del bucle no canónico está en línea con nuestros resultados de los ensayos A/D, donde las membranas de V. radiata eran susceptibles a la inhibición de NEM, pero su susceptibilidad (es decir, la accesibilidad del bucle Nad3 TMH1-2) no cambió. tras la incubación sin sustrato a 37 °C ("desactivación") o la preactivación con sustrato (Fig. 4 y Datos ampliados, Fig. 7). Esto implica que los bucles de CI de la planta pueden muestrear una variedad de conformaciones a lo largo del continuo catalítico tanto en ausencia como en presencia de sustrato. Por lo tanto, las plantas pueden tener una barrera energética más baja entre los estados a lo largo de la vía catalítica de CI y una falta de estados abierto/cerrado y activo/desactivo, al menos como se define bioquímicamente actualmente. Aunque previamente se han mostrado pequeñas barreras termodinámicas entre los estados A y D para la levadura30 y se han propuesto para una cepa de ratón que alberga una mutación P25L en Nad6 TMH2 (ref. 41), estos casos no son equivalentes a nuestras observaciones. En la levadura y el ratón P25L, CI en ausencia de sustrato se convierte rápidamente en un estado D estable, con una susceptibilidad casi completa a NEM y protección ofrecida por la preactivación, aunque no al mismo nivel que el tipo salvaje. Por el contrario, V. radiata CI en membranas aisladas estaba ~40 % en un estado "similar a A" no sensible, sin protección por preactivación. Por lo tanto, las plantas se suman al repertorio de observaciones que deben ser consideradas en discusiones abiertas/cerradas, activas/desactivadas.

En general, encontramos que V. radiata CI dentro de SC I + III2 mostró una configuración de bucle intermedio, una transición A/D no canónica y diferencias muy limitadas en el ángulo entre los brazos de CI en presencia del dominio del puente. Nuestras definiciones y ensayos actuales para la estructura y función de CI pueden necesitar una actualización a la luz de los estudios de organismos más allá de los sistemas modelo heterótrofos tradicionales. Será interesante continuar examinando la transición A/D y la transferencia de electrones reversos en plantas usando membranas mitocondriales, partículas submitocondriales y proteoliposomas36 reconstituidos de V. radiata y otras especies de plantas. También será importante estudiar la estructura de la planta CI en supercomplejos bajo condiciones cíclicas, para examinar si está presente una apertura y cierre de los brazos de la CI. El estudio adicional de CI y sus supercomplejos en plantas y en diversos organismos a lo largo del árbol de la vida permitirá una comprensión más matizada del mecanismo de la enzima, incluidas características tanto universales como específicas de clado.

Este trabajo se publica junto con un estudio sobre la estructura crio-EM del supercomplejo I + III2 de Arabidopsis thaliana a una resolución de 2 Å53. No se intercambiaron datos experimentales ni versiones manuscritas entre los grupos antes de que se aceptaran los artículos, de manera que los estudios independientes se complementarían y validarían mejor entre sí.

Las semillas de V. radiata se incubaron en lejía al 1% (v/v) durante 20 min y se enjuagaron hasta que el agua alcanzó un pH neutro. Luego, las semillas se embebieron en una solución de CaCl2 6 mM durante aproximadamente 24 h en la oscuridad. Las semillas se sembraron en bandejas de plástico colocadas entre gasas húmedas hasta una densidad final de 0,1 g cm−2 y brotaron en la oscuridad a 20 °C durante 5 días. Las semillas recibieron 2 l de agua el día 1 de la siembra y 0,5 l adicionales de agua el día 2. El día 5, los brotes etiolados se recolectaron separando los hipocotilos de las raíces y los cotiledones a mano. Los hipocotilos se procesaron adicionalmente para la purificación mitocondrial como se describió anteriormente9,15. En resumen, los hipocotilos se homogeneizaron en un mezclador Waring con tampón de homogeneización (sacarosa 0,4 M, EDTA 1 mM, MOPS-KOH 25 mM, tricina 10 mM, PVP-40 al 1 % p/v, cisteína 8 mM y BSA al 0,1 % pv, pH 7.8), filtrado a través de varias capas de Miracloth y centrifugado durante 10 min a 1.000 g a 4 °C. El sobrenadante resultante se volvió a centrifugar durante 30 min a 12.000 g a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron en tampón de lavado (sacarosa 0,4 M, EDTA 1 mM, MOPS-KOH 25 mM y BSA al 0,1 % p/v, pH 7,2) y se centrifugaron a 1000 g durante 5 min a 4 °C. El sobrenadante se centrifugó durante 45 min a 12 000 g a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron en tampón de lavado y se cargaron en gradientes escalonados de sacarosa (35 %, 55 % y 75 % p/v) y se centrifugaron durante 60 min a 72 000 g a 4 °C. Los gradientes de sacarosa se fraccionaron con un fraccionador de gradiente de pistón BioComp conectado a un colector de fracciones Gilson F203B siguiendo la absorbancia a 280 nm. Las fracciones mitocondriales relevantes se combinaron y diluyeron 1:5 v/v en tampón de dilución (10 mM MOPS-KOH y 1 mM EDTA, pH 7,2). La muestra se centrifugó durante 20 min a 16.000 g y 4 °C. El precipitado se resuspendió en tampón de resuspensión final (HEPES 20 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 10 % v/v, pH 7,5) y se centrifugó durante 20 min a 16 000 g a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento (mitocondrias purificadas) se dividió en alícuotas, se congeló y almacenó a -80 °C.

Todos los pasos se llevaron a cabo a 4 °C con materiales preenfriados. Los gránulos mitocondriales de V. radiata congelados se descongelaron, se resuspendieron en agua bidestilada a 5 ml g-1 de gránulo y se homogeneizaron con un homogeneizador de vidrio Dounce. Se añadió cloruro de potasio al homogeneizado hasta una concentración final de 0,15 M y se homogeneizó de nuevo. El homogeneizado se centrifugó a 45.000 g durante 90 min. Los sedimentos se resuspendieron y homogeneizaron de nuevo en tampón M (Tris 20 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10 % v/v, DNasa I 10 U ml−1, ditiotreitol 2 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo al 0,002 % (PMSF, pH 7,4). Luego, el homogeneizado se centrifugó a 45 000 g durante 90 min a 4 ° C. Los sedimentos se resuspendieron en 3 ml de tampón M por gramo de material de partida y se homogeneizaron nuevamente. La concentración de proteína del homogeneizado se determinó con un kit de ensayo Pierce BCA y se diluyó a una concentración final de 20 mg ml-1 en glicerol al 30 % (v/v) para su almacenamiento a -80 °C.

Las membranas mitocondriales lavadas de V. radiata se descongelaron en hielo. Los complejos de membrana se extrajeron mediante agitación durante 60 min a 4 °C con digitonina en una proporción de 4:1 (p/p) y una concentración del 1 % (p/v) en Buffer MX (30 mM HEPES, 150 mM acetato de potasio, 10 % glicerol v/v, EDTA 1 mM y PMSF al 0,002 %). A continuación, el extracto se centrifugó a 25.500 g durante 30 min a 4 °C y se añadió paso a paso el polímero anfipático A8-35 al sobrenadante hasta una concentración final del 0,5 % (p/v) mientras se agitaba durante 40 min. A continuación, la muestra se transfirió a membranas de diálisis con un valor de corte de 12 000–14 000 Da y se dializó en tampón de diálisis (HEPES 30 mM, acetato de potasio 150 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 5 % (v/v) y γ-ciclodextrina 200 μM, a pH 7,7) durante 3 h a 4 °C. A continuación, la membrana de diálisis se transfirió a un segundo tampón de diálisis (HEPES 30 mM, acetato de potasio 150 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 5 % (v/v) y BioRad Bio-beads SM-2 al 0,04 % (p/v), a pH 7.7) y se dializó durante la noche (~16 h) a 4 °C. La muestra se recuperó de la membrana de diálisis y se concentró con concentradores centrífugos de proteínas con un límite de peso molecular de 100.000 Da. El concentrado se cargó en gradientes lineales de sacarosa del 20 al 45 % (p/v) (en HEPES 15 mM y KCl 20 mM, pH 7,8) producidos con la configuración de fábrica de un generador de gradientes BioComp Instruments y se centrifugaron durante 23 h a 243 500 g. a 4 °C. A continuación, los gradientes se fraccionaron utilizando un fraccionador de gradiente de pistón BioComp conectado a un colector de fracciones Gilson F203B siguiendo la absorbancia a 280 nm. A lo largo de la purificación, la actividad NADH-deshidrogenasa de SC I + III2 se midió espectroscópicamente con un ensayo de actividad de ferricianuro (FeCy) adaptado de la ref. 54 como se describió previamente9,15. Ver detalles en la siguiente sección.

Para la preparación de la rejilla cryoEM, se agruparon las fracciones relevantes del gradiente de sacarosa, se intercambiaron tampones para eliminar la sacarosa y se concentraron hasta una concentración de proteína final de ~1,5 mg ml−1. Para eliminar la sacarosa, las fracciones agrupadas se diluyeron en HEPES 30 mM, acetato de potasio 150 mM, EDTA 1 mM y PMSF al 0,002 %, pH 7,7 y se concentraron utilizando concentradores centrífugos de proteínas con un límite de peso molecular de 100.000 Da. Los pasos de dilución y concentración se repitieron varias rondas hasta que la concentración final estimada de sacarosa fue <1% (p/v).

Para la purificación bioquímica completa de SC I + III2, la muestra se concentró hasta un volumen final de 200 µl y se sometió a SEC. La muestra se inyectó en una columna Superose 6 10-300 usando un sistema BioRad NGC y BioFrac Fraction Collector. Se controló la absorbancia a 280 nm y 420 nm para la recogida de fracciones relevantes. Las fracciones de SEC seleccionadas se agruparon y concentraron utilizando concentradores centrífugos con un corte de 30.000 Da. La concentración de proteína se midió con un kit de ensayo Pierce BCA y se diluyó a ~0,185 mg ml−1 en Buffer MX (ver arriba) y glicerol al 30 % (v/v). La muestra se dividió en alícuotas y se almacenó en nitrógeno líquido.

Las alícuotas de las muestras se mezclaron con 5–8 µl de colorante de carga (5 % (p/v) de azul brillante G, ácido amino cúprico 0,5 M y 50 % (v/v) de glicerol), cargados en Tris al 3–12 % moldeado a mano. –geles PAGE de glicina y ejecutar a 4 °C. El tampón del ánodo era Tris 25 mM y glicina 192 mM a pH 8,3. El tampón de cátodo azul oscuro era Tris 25 mM, glicina 192 mM y azul de Coomassie G-250 al 0,02 % (p/v); el tampón de cátodo azul claro era idéntico al tampón azul oscuro excepto que contenía 0,002 % de azul de Coomassie G-250 (p/v). Los geles se corrieron a voltaje constante en un tampón azul oscuro durante 30 min a 150 V, luego se cambiaron a un tampón azul claro y se corrieron durante 2 h más a 200 V.

El ensayo de actividad de NADH-deshidrogenasa en gel se realizó sobre la base de la ref. 55. Los geles se incubaron en 10 ml de tampón de reacción (1,5 mg ml−1 de azul de nitrotetrazolum en Tris-HCl 10 mM pH 7,4 y NADH 150 µM), se agitaron a temperatura ambiente durante ~10 min mientras las bandas moradas (que indican NADH-deshidrogenasa actividad) desarrollada. Una vez que las bandas se desarrollaron lo suficiente, la reacción se inactivó utilizando una solución de metanol al 50 % (v/v) y ácido acético al 10 % (v/v). Después de la formación de imágenes, el gel se tiñó con tinción de Coomassie (0,1 % p/v de Coomassie Brilliant Blue R250, 10 % v/v de ácido acético glacial y 50 % v/v de metanol).

Los ensayos se realizaron utilizando placas de 96 pocillos en un espectrofotómetro Spectramax M2 de Molecular Devices. Se utilizaron los siguientes reactivos y fabricantes especializados según fue necesario: NADH (MilliporeSigma), dNADH (nicotinamida hipoxantina dinucleótido, MilliporeSigma) cyt c purificada de corazón equino (MilliporeSigma), FeCy (MilliporeSigma) decilubiquinona (DQ; Santa Cruz Biotechnology), antimicina A ( MilliporeSigma), piericidina A (Cayman Chemicals), superóxido dismutasa (MilliporeSigma) y KCN (Honeywell). La oxidación de NADH se midió a 340 nm; La reducción de cyt c se midió a 550 nm. La longitud del camino de nuestra reacción en las placas de 96 pocillos y los coeficientes de extinción de NADH y cyt c utilizados en los cálculos de actividad se determinaron experimentalmente (ver más abajo). Se utilizó un coeficiente de extinción de 5,4 mM−1 cm−1 para NADH y dNADH; se utilizó un coeficiente de extinción de 6,5 mM−1 cm−1 para el citocromo c oxidado reducido. La longitud del camino de nuestro ensayo fue de 0,531 cm. Las mediciones de las tasas iniciales se realizaron en réplicas (detalladas a continuación), se promediaron y se corrigieron de fondo. Las cifras muestran los promedios y el error estándar de la media.

Para determinar experimentalmente el coeficiente de extinción del citocromo c, realizamos curvas estándar para el citocromo c equino oxidado y reducido. Cyt c liofilizado se diluyó en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM y glicerol al 10% (v/v) hasta una concentración madre de 25 mM. Las concentraciones de trabajo se realizaron diluyendo el stock en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM y tampón de glicerol al 10 % (v/v) en un rango de 25–125 μM. Para oxidar o reducir el citocromo c, se añadieron FeCy de potasio 400 μM o ditionito de sodio 2 mM a las concentraciones de trabajo de citocromo c. Para garantizar el estado de oxidación del citocromo c en cada concentración de trabajo, obtuvimos exploraciones espectrales de 350 a 600 nm cada 2 nm, inspeccionamos las trazas y calculamos la relación A550 nm/A565 nm. Una relación A550 nm/A565 nm >9,0 se consideró totalmente reducida. Con estas muestras de citocromo c completamente reducido y oxidado, medimos la absorbancia a 550 nm para crear curvas estándar para el citocromo c reducido y oxidado. Las mediciones de la curva estándar se realizaron en tres réplicas con cinco concentraciones de citocromo c, promediadas y corregidas de fondo. La desviación estándar se utilizó para calcular el error. Al medir la pendiente, determinamos un coeficiente de extinción de 12,7 mM−1 para el citocromo c reducido y de 6,2 mM−1 para el citocromo c oxidado a 550 nm. Luego restamos la absorbancia del citocromo c oxidado de la del citocromo c reducido y trazamos una curva estándar para obtener un coeficiente de extinción para el citocromo c oxidado reducido a 550 nm de 6,5 mM−1. Dada la longitud del camino de la cubeta (1 cm), esto corresponde a un coeficiente de extinción de 6,5 mM−1 cm−1.

El coeficiente de extinción de NADH a 340 nm se determinó experimentalmente midiendo el A340 nm de NADH reducido a diferentes concentraciones en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM y glicerol al 10% (v/v). Las mediciones de la curva estándar se realizaron en tres repeticiones con cinco concentraciones de NADH en un rango de 10 a 100 μM, promediadas y con corrección de fondo. Se utilizó la desviación estándar para calcular el error. Determinamos un coeficiente de extinción para NADH reducido a 340 nm de 5,4 mM−1. Dada la longitud del camino de la cubeta (1 cm), esto corresponde a un coeficiente de extinción de 5,4 mM−1 cm−1.

Calculamos la longitud del camino de 200 μl de nuestro tampón de reacción (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM y glicerol al 10 % (v/v)) en placas de 96 pocillos utilizando la función PathCheck del espectrofotómetro Spectramax M2 según las instrucciones del fabricante. Brevemente, la función PathCheck se utilizó para determinar la longitud del camino de 200 μl de nuestro tampón en una placa de 96 pozos, normalizada por una lectura de referencia de PathCheck de 1 ml de tampón en una cubeta de 1 cm, ambos a 550 nm. Se realizó otra lectura A550 para la placa de 96 pocillos sin PathCheck. La longitud de la trayectoria de la placa se calculó como A550 nm (sin PathCheck)/A550 nm (con PathCheck). Las mediciones de la longitud de la trayectoria se realizaron en tres repeticiones y se utilizó la desviación estándar para calcular el error. Determinamos que la longitud del camino de 200 μl de nuestro tampón de reacción es de 0,531 cm.

Después de determinar lo anterior, se usaron los coeficientes de variación de las mediciones de actividad, los coeficientes de extinción y la longitud del camino para calcular el coeficiente de variación del ensayo de actividad. El error absoluto se calculó multiplicando la actividad específica promedio y el coeficiente de variación del ensayo de actividad.

La muestra de proteína se añadió a 1 ml de mezcla maestra de tampón de reacción (Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM y FeCy 1 mM, pH 7,4) y se mezcló completamente mediante agitación vorticial. La reacción se inició mediante la adición de NADH hasta una concentración final de 200 µM. Los pocillos se mezclaron pipeteando y agitando la placa durante 5 s antes de registrar cada 4 s durante 3 min. Las mediciones se realizaron en cuatro repeticiones.

La mezcla maestra de reacción consistió en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM, glicerol al 10 % (v/v), superóxido dismutasa 50 U ml−1, DQ 100 µM, KCN 4 µM, cyt c 100 µM correspondiente, y el inhibidor respiratorio relevante (antimicina A 1 µM y piericidina A 20 µM, ambos disueltos en DMSO). Las muestras SC I + III2 se añadieron a la mezcla correspondiente a 7,6 µg ml−1 (5 nM), se mezclaron mediante volteo y se dividieron en alícuotas en la placa de 96 pocillos hasta un volumen total de 200 µl. Cada reacción se inició mediante la adición de NADH 10 µM y se mezcló brevemente mediante pipeteo antes de registrar cada 5 s durante 10 min. Las mediciones se realizaron en tres a cuatro repeticiones.

La mezcla maestra de reacción consistió en HEPES 20 mM, NaCl 50 mM, glicerol al 10 % (v/v), BSA al 0,1 % (p/v), CHAPS al 0,1 % (p/v), digitonina al 0,1 % (p/v) y DQ 100 µM, pH 7,4. Se añadieron membranas mitocondriales lavadas de V. radiata o S. scrofa a la mezcla correspondiente a 40 μg ml−1, se mezclaron mediante volteo y se dividieron en alícuotas en la placa de 96 pocillos hasta un volumen total de 200 μl. Para la condición desactivada de V. radiata, la placa se incubó a 37 °C durante 20 min, después de lo cual se añadieron piericidina A 15 μM (o una cantidad equivalente de DMSO) y deaminoNADH 5 μM (dNADH; o una cantidad equivalente de tampón) a los pocillos correspondientes y mezclado mediante pipeteo. Diez segundos después de esta adición, se añadió NEM o agua 2 mM a los pocillos correspondientes y se mezcló mediante pipeteo. Después de la adición de NEM, la placa se incubó a temperatura ambiente (25 °C) durante 15 min y se cubrió de la luz. Las reacciones se iniciaron inmediatamente después mediante la adición de NADH 100 μM o dNADH 100 μM en los pocillos correspondientes y se mezclaron brevemente mediante pipeteo antes de registrar cada 4 s durante 5 min. El ensayo de condición aislada utilizó una configuración similar, excepto que no se aplicó una incubación de 20 min a 37 °C. Las mediciones se realizaron en cuatro repeticiones. Para las membranas de S. scrofa, se usaron condiciones equivalentes, excepto que no se emplearon piericidina A ni dNADH. Las mediciones se realizaron en 6-12 repeticiones.

La muestra para la preparación de la rejilla era una muestra heterogénea, es decir, fracciones agrupadas, concentradas e intercambiadas con tampón del gradiente de sacarosa: ~1,5 mg ml−1 de proteína en HEPES 30 mM, acetato de potasio 150 mM, EDTA 1 mM y 0,002 % (v/ v) PMSF, pH 7,7. Se añadió digitonina a la muestra como último paso a una concentración final de 0,2% (p/v) de digitonina. Las rejillas de cobre de malla Quantifoil 1.2/1.3 se descargaron luminiscentes durante 60 s a 30 mA antes de la aplicación de la muestra. La muestra (4 µl) se aplicó a cada rejilla a 10 °C y 90 % de humedad y se incubó en la rejilla durante 20 s antes de transferir durante 4 s y congelar por inmersión en etano líquido usando un congelador de inmersión Leica EM GP2.

Se recopilaron un total de 21 815 películas de alta calidad utilizando SerialEM v3.8.5 en un microscopio Glacios de 200 kV equipado con un detector Quantum K3, con un aumento nominal de 56 818 (0,44 Å por píxel en modo de superresolución). Una dosis de 20 electrones Å−2 s−1 con 3 s de exposición se fraccionó en 75 fotogramas para cada película.

Las películas sin procesar de superresolución se agruparon dos veces, lo que resultó en un tamaño de píxel de 0,88 Å. El movimiento de estas películas se corrigió con la corrección de movimiento basada en parches de cryoSPARC, seguido de la estimación de la función de transferencia de contraste por micrografía con CTFFIND4.1, ambos implementados en cryoSPARC56. Las partículas se seleccionaron inicialmente con el selector manual de cryoSPARC, que luego se utilizó para entrenar la implementación de Topaz57 en cryoSPARC, con tres iteraciones. A esto le siguió la clasificación 2D, la reconstrucción ab initio 3D y el refinamiento 3D en cryoSPARC. En la última iteración de Topaz, se extrajeron 593 080 partículas, se submuestrearon dos veces (tamaño de píxel de 1,76 Å) con cajas de 300 píxeles2 y se clasificaron ampliamente en 2D para producir 278 675 partículas correspondientes a SC I + III2 y 58 798 partículas correspondientes a CI solo. Estos conjuntos de partículas luego se volvieron a extraer sin muestreo descendente (tamaño de píxel de 0,88 Å) con cajas de 600 píxeles2 y se usaron en varias rondas de generación de modelos múltiples ab initio en cryoSPARC para la clasificación de las partículas. Estas rondas de generación de modelos ab initio eliminaron imágenes de partículas adicionales de mala calidad y dieron como resultado seis clases de partículas SC I + III2 (dos clases con el puente de ferredoxina y cuatro sin él) y una sola clase de partículas CI solas.

Para cada clase de partículas, se realizó un refinamiento homogéneo inicial con simetría C1 seguido de rondas iterativas de refinamiento con desenfoque por partícula, aberraciones de orden superior y escala por partícula. Finalmente, se realizó una ronda de refinamiento no uniforme58, dando como resultado los mapas finales para cada clase. Las partículas alineadas, escaladas y corregidas de la clase SC I + III2 con puente más cerrado (clase 1; 123 461 partículas) se usaron en una serie de refinamientos locales con enmascaramiento alrededor de distintas partes del complejo. Estos mapas locales se combinaron en un mapa compuesto utilizando la herramienta de combinación de mapas de Phenix59. Se accedió a todas las suites de software utilizadas para el procesamiento y el refinamiento de datos, excepto cryoSPARC, a través del consorcio SBGrid60.

Se usaron modelos para el brazo periférico de V. radiata CI y el módulo de bombeo proximal (PP) y CIII2 como plantillas9,15. Para el módulo de bombeo distal (Pd) de CI y los dominios puente, los modelos de A. thaliana11 se usaron como modelos iniciales después de la corrección de secuencia en homólogos de V. radiata. Estos modelos se ajustaron a los mapas de refinamiento enfocados de mayor resolución para la construcción de modelos atómicos separados de CI y CIII2 en Coot61. El refinamiento del modelo en el espacio real se realizó en Phenix59, y los parámetros de desplazamiento atómico del grupo se refinaron en el espacio recíproco. Las figuras de visualización se produjeron en ChimeraX62,63.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las micrografías cryoEM sin procesar utilizadas en este estudio están disponibles en la base de datos del Archivo de imágenes públicas de microscopía electrónica (EMPIAR) con el código de acceso EMPAIR-11225. El mapa compuesto, los refinamientos enfocados y el modelo para el SC I+III2 puenteado de V. radiata están disponibles en la base de datos de microscopía electrónica (EMDB) y el banco de datos de proteínas (PDB) con códigos de acceso EMD-27934 para el SC I+III2 puenteado compuesto mapa de clase 1 y PDB-8E73 para el modelo estructural. Hay mapas adicionales disponibles en EMDB con códigos de acceso: EMD-29088 (centrado en el puente CI); EMD-29089 (CI centrado en el talón); EMD-29090 (enfocado en el dominio de la bomba distal de CI); EMD-29091 (centrado en CIII2); EMD-29092 (centrado en el módulo N de CI); EMD-29093 (centrado en el dominio de MPP proximal CIII2); EMD-29094 (centrado en el dominio MPP distal CIII2); EMD-29095 (SC I+III2 puente clase 2); EMDB-28798 (sin puente SC I+III2 clases 1); EMDB-29191 (sin puente SC I+III2 clases 2); EMDB-29190 (sin puente SC I+III2 clases 3); EMDB-29203 (sin puente SC I+III2 clases 4); y EMDB-28799 (CI solo). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01373-5

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Descargar referencias

Agradecemos a R. Murguia, Q. Zhou, H. Tan, K. Campos y todos los miembros del laboratorio por sus contribuciones a los aislamientos mitocondriales de V. radiata. El conjunto de datos cryoEM se recopiló en las instalaciones de UC Davis BioEM Core. Agradecemos a F. Guo por su excelente asistencia técnica. Este material se basa en el trabajo respaldado por el Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Ciencias, Oficina de Ciencias Energéticas Básicas con el número de adjudicación DE-SC0022293. Este informe fue preparado como una cuenta del trabajo patrocinado por una agencia del gobierno de los Estados Unidos. Ni el gobierno de los EE. UU. ni ninguna agencia del mismo, ni ninguno de sus empleados, ofrece ninguna garantía, expresa o implícita, ni asume ninguna obligación o responsabilidad legal por la exactitud, integridad o utilidad de cualquier información, aparato, producto o proceso divulgado, o representa que su uso no infrinja los derechos de propiedad privada. La referencia en el presente a cualquier producto, proceso o servicio comercial específico por nombre comercial, marca comercial, fabricante o de otro modo no constituye ni implica necesariamente su respaldo, recomendación o favorecimiento por parte del gobierno de los EE. UU. o cualquier agencia del mismo. Los puntos de vista y opiniones de los autores expresados ​​en este documento no necesariamente declaran o reflejan los del gobierno de los EE. UU. o cualquier agencia del mismo.

M. Maldonado

Dirección actual: Departamento de Biología Vegetal, Universidad de California, Davis, CA, EE. UU.

Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de California, Davis, CA, EE. UU.

M. Maldonado, Z. Fan, KM Abe y JA Letts

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Conceptualización: JAL y MM Metodología: JAL y MM Investigación: JAL, MM, KMA y ZF Visualización: JAL, MM, KMA y ZF Adquisición de fondos: JAL y MM Administración del proyecto: JAL Supervisión: JAL y MM Redacción: borrador original: MM Redacción —revisión y edición: JAL, MM, KMA y ZF

Correspondencia a M. Maldonado o JA Letts.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a Markus Schwarzlander, Ian Møller y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

(a) Tabla de purificación que detalla la concentración de proteína (mg/ml), actividad total (μmol/min), actividad específica (μmol/(min*mg) y recuperación (%, normalizado a proteína extraída) para cada paso principal de purificación. (b) ) Ensayo de actividad en gel del complejo I (CI) de fracciones detalladas en (a) utilizando PAGE azul nativo. Las bandas moradas indican actividad de CI. (cd) Fraccionamiento en gradiente de sacarosa de la fracción posterior a la concentración (7 en el panel a) después de la ultracentrifugación. (c) Cromatograma de gradiente de sacarosa (línea azul, absorbancia a 280 nm) y actividad total (μmol/min) (triángulos verdes, determinados con ensayo espectroscópico de ferricianuro) para cada fracción de gradiente de sacarosa. El recuadro punteado indica las fracciones agrupadas para la columna de exclusión por tamaño ( SEC). (d) Ensayo de actividad en gel CI de fracciones seleccionadas de (c). (ef) Purificación SEC de fracciones agrupadas de (cd). (e) Cromatograma a 280 nm y 420 nm. (f) CI in- ensayo de actividad de gel de fracciones recogidas de (e).Fracciones correspondientes a SC I + III2 marcadas con recuadro discontinuo.C, muestra concentrada post-SEC; L, carga. Estos resultados son representativos de 26 preparaciones SC I + III2.

Datos fuente

( a ) Micrografía representativa de 21.815 recopilados. La barra de escala es de 100 nm. (b) Clases 2D representativas de partículas SC I + III2. (c) Pipeline de refinamiento y clasificación 3D inicial. Las curvas de correlación de capa de Fourier (FSC) para los refinamientos de clase individuales se muestran sin enmascaramiento (naranja), suelto (verde) y apretado (azul). Se indica la resolución a la que el FSC enmascarado ajustado cruza el límite del patrón oro de 0,143 (línea discontinua).

Se realizaron refinamientos de máscaras individuales utilizando las máscaras que se muestran en magenta para mejorar la calidad del mapa. Las curvas de correlación de capa de Fourier (FSC) para los refinamientos enfocados individuales se muestran sin enmascaramiento (naranja), suelto (verde) y ajustado (azul). Se indica la resolución a la que la máscara ajustada FSC cruza el límite estándar de oro de 0,143 (línea discontinua). Los mapas enfocados resaltados con cuadros verdes se combinaron en el mapa compuesto final del puente SC I + III2 (arriba a la izquierda).

Subunidades mostradas en caricaturas de colores sobre densidad semitransparente en gris.

( a ) Alineación de secuencias de isoformas de MPP-α anotadas en el proteoma de V. radiata. Isoforma modelada en SC I + III2 (LOC106765382) en azul, Isoforma modelada en SC III2 + IV (correspondiente a LOC106774328) en gris. Caja marrón transparente, secuencia de señales. Cuadro naranja transparente, residuos de interfaz con NDUB9 de CI. Residuos que difieren marcados en letra roja. Caja amarilla transparente, bucle rico en gly involucrado en el reconocimiento del sustrato MPP. (b) Regiones clave de ajuste de mapa a modelo de las subunidades MPP-α modeladas para SC I + III2 y SC III2 + IV, encajan en el mapa SC I + III2. LOC106765382 (SC I + III2) en azul, LOC106774328 (SC III2 + IV) en gris. ( c ) Interfaz MPP-α con NDUB9 de CI. Proteína correspondiente a LOC106765382 (SC I+III2) en azul y LOC106774328 (SC III2+IV) en gris. ( de ) Tríada catalítica de MPP-β en protómero proximal a CI ( d ) y distal a CI ( e ). Nótese la falta de densidad para un supuesto Zn2+.

(ab) Comparación del puente de ferredoxina (superficie amarilla) en V. radiata (a) y T. thermophila (b) (PDB 7TGH13,). Supercomplejos alineados por CIII2. CI y CIII2 coloreados como en (a). ( ch ) Comparación entre especies de interfaces SC I + III2 en V. radiata (c, f), O. aries (d, g PDB 6QC512,) y T. thermophila (e, h). Las principales subunidades que interactúan se muestran en dibujos animados. ( ce ) Interfaces de matriz que involucran MPP-α (α) y MPP-β (β), alineadas por MPP-β. ( fh ) Interfaces de espacio de membrana e intermembrana, alineadas por NDUA11. Tenga en cuenta que V. radiata QCR7 se muestra a modo de comparación, pero no participa en la interfaz.

( ab ) Resumen de conformaciones de bucle CI. ( a ) Bucles clave, hélices y cadenas β discutidas en el texto que se muestra en una caricatura en color sobre la superficie transparente SC I + III2. El recuadro (cuadrado discontinuo) se muestra en detalle en (b). Se marca la configuración de cada bucle, así como los residuos clave y las características. (cd) Tasas de actividad para la transición A/D en membranas porcinas (S. scrofa, símbolo de cerdo) (c) y V. radiata (símbolo de planta) (d). Se muestra actividad en presencia o ausencia de NEM 2 mM, piericidina A 20 μM, preactivación con NADH 5 μM o dNADH 5 μM y desactivación térmica para 4-12 repeticiones. Los datos se muestran como valores individuales y media ± desviación estándar. Análisis estadístico con ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. **, p < 0,01; ****, p < 0,0001. Los datos son representativos de dos aislamientos de membrana mitocondrial de V. radiata completamente caracterizados (NADH y dNADH).

Análisis de variabilidad 3D de todas las partículas puente SC I + III2 de V. radiata (componente 000). La película muestra el movimiento limitado entre los brazos de matriz y membrana de CI y la flexibilidad de la interfaz CI-CIII2 dentro del plano de la membrana.

Análisis de variabilidad 3D de todas las partículas SC I + III2 puenteadas de V. radiata (componente 001). La película muestra la flexibilidad de la interfaz CI-CIII2 perpendicular al plano de la membrana.

Geles nativos azules sin recortar que se muestran en Datos extendidos Fig. 1b, d, f.

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Reimpresiones y permisos

Maldonado, M., Fan, Z., Abe, KM et al. Características específicas de la planta del supercomplejo respiratorio I + III2 de Vigna radiata. Nat. Plantas 9, 157–168 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01306-8

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Recibido: 02 Septiembre 2022

Aceptado: 08 noviembre 2022

Publicado: 29 diciembre 2022

Fecha de emisión: enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01306-8

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